诱导干细胞心肌分化中甲基化修饰作用探讨

发布时间：2019-09-29 09:15

【摘要】：目的在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌样细胞定向分化过程中的早期相关基因启动子区甲基化修饰作用探讨。方法1.实验分组:(1)空白对照组(未经处理的C3H10T1/2细胞),(2)阴性对照组(感染慢病毒空载体的C3H10T1/2细胞Lv-GFP),(3)高表达Islet-1的C3H10T1/2细胞组,分为1周、2周、3周、4周四个时间点(Islet-1-1W、Islet-1-2W、Islet-1-3W、Islet-1-4W),(4)在过表达Islet-1的C3H10T1/2中加入5-Aza的细胞组,为Islet-1+5-Aza组,(5)在过表达Islet-1的C3H10T1/2中加入BIX01294的细胞组,为Islet-1+BIX01294组。2.实验方法:荧光倒置相差显微镜观察各组细胞的形态与绿色荧光,流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)检测转染效率,用蛋白印迹法检测Islet-1蛋白表达,用实时荧光定量PCR检测Mef2c、GATA4、Nkx2.5的mRNA的时序性表达,用免疫荧光检测心肌特异蛋白cTnT、CX43的表达,用甲基化特异PCR检测各组细胞的心肌特异早期基因CPG岛的DNA甲基化水平,用染色质免疫共沉淀检测在GATA4、Nkx2.5启动子区结合的组蛋白甲基化水平。结果1.荧光倒置显微镜显示绿色荧光稳定表达;流式细胞检测islet-1的转染效率为91.7%;westernblot显示转染islet-1细胞组高表达islet-1蛋白;与空白和阴性对照组相比,islet-1组的细胞形态呈现出方向均一、短棒状、排列紧密;免疫荧光结果表明,转染islet-1细胞心肌特异性蛋白ctnt在细胞质中表达,心肌早期发育的特异性缝隙连接蛋白cx43在细胞膜上表达;q-pcr检测心肌特异早期转录因子nkx2.5、gata4和mef2c的表达逐渐增高,在第三周最明显(*p0.05),第四周略有降低。2.msp检测gata4启动子区的cpg岛的第二个位点(1329bp-1489bp)dna甲基化水平,甲基化水平逐渐降低,在第三周最低(*p0.05);msp检测nkx2.5启动子区cpg岛(51bp-219bp)的dna甲基化水平,各组几乎没有变化;染色质免疫共沉淀(chip)结果显示实验组gata4、nkx2.5基因启动子区组蛋白二甲基化水平依次降低,于第3周最低,且实验组各组均低于空白组和阴性对照组(*p0.05)。3.chip检测显示islet-1+5-aza组的gata4启动子区组蛋白甲基化水平低于lv-islet-1组(*p0.05);msp检测显示islet-1+bix01294组gata4启动子区dna甲基化水平低于lv-islet-1组(*p0.05)。结论1.在诱导mscs心肌分化中,gata4启动子区dna甲基化与gata4的表达负相关,而nkx2.5可能不受dna甲基化调控。2.在本研究过程中组蛋白h3k9位点的二甲基化水平与gata4、Nkx2.5的表达呈现负相关。3.在本研究过程中,心肌早期特异基因GATA4启动子区结合的组蛋白H3K9位点的二甲基化水平和DNA甲基化水平呈现正相关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54

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本文编号：2543841