SIRT1保护内皮细胞氧化损伤，抑制促血栓分子表达，影响DVT形成的机制研究

发布时间：2019-10-14 03:31

【摘要】：深静脉血栓形成(Deep venous thrombosis,DVT)发病率高,危害大,难以早期预测诊断。DVT发病机制复杂,涉及血管内皮细胞、白细胞、血小板及凝血因子和纤溶系统等诸多角色及系统。静脉内皮细胞结构和功能的紊乱是DVT形成的始动因素,其通过调节血管的收缩与舒张,血小板与白细胞的粘附、活化、聚集,打破凝血/抗凝、纤溶/抗纤的动态平衡,影响DVT的发生发展。近年来研究表明,氧化应激引起静脉内皮细胞损伤是DVT形成的重要因素之一,活性氧自由基可导致内皮细胞氧化损伤、老化、凋亡,启动促凝血反应引发血栓形成。同时,在动脉血栓中的研究发现,沉默信息调节因子1 (Silent information regulator 1, SIRT1)可通过抑制TNF-α介导的炎性反应改善内皮细胞功能,修复内皮细胞损伤,减少动脉血栓形成。本课题组前期在DVT动物模型及静脉内皮细胞损伤模型等体内和体外实验中,采用RT-PCR、Western blot、基因芯片、生物信息学分析等技术发现并验证了KLF15、Rac1、MCP-1、IL-18和NF-κB等调控氧化应激的核心基因、蛋白的表达变化可促进内皮细胞损伤,导致DVT形成。然而,上述关键基因在氧化应激反应中的上下游调控关系仍不明朗；氧化应激诱导静脉内皮细胞损伤凋亡、释放促血栓分子、促进DVT形成的具体信号转导机制也不完全清楚；SIRT1是否能修复静脉内皮细胞损伤,进而抑制DVT形成的作用和机制目前尚未报到。为此,本课题旨在探讨：①氧化应激损伤(Oxidative Stress Injury, OSI)诱导静脉内皮细胞损伤、凋亡的信号转导通路：②沉默信息调节因子1(SIRT1)在OSI诱导内皮细胞损伤凋亡中的保护作用及调控机制；③SIRT1抑制内皮细胞分泌促血栓分子、影响DVT形成的作用及分子机理。动物实验中,对SIRT1和氧化应激损伤分子标志物一活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)在小鼠DVT模型中的表达变化作一初步研究。细胞实验中,建立过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型,通过过表达和抑制SIRT1,探讨SIRT1及下游PI3-K/Akt/GSK3β、MAPKs(c-Jun、ERK1/2、p38)、NF-κB、Nfr2/ARE等关键基因、信号通路调控HUVECs凋亡、分泌促血栓相关分子,进而影响DVT形成的作用及分子机制。为找到防治DVT形成的关键靶点提供新的理论依据。[目的]1.研究氧化应激反应诱导静脉内皮细胞损伤、凋亡的具体信号转导通路;2.探讨SIRT1对氧化应激诱导静脉内皮细胞损伤的修复作用及调控机制；3.探索SIRT1调节内皮细胞分泌促血栓分子、抑制DVT形成的分子机理。[方法]1.体内实验：90只C57小鼠随机分为空白组30只(Control,n=30)、假手术组30只(Sham, n=30)、DVT组30只(DVT, n=30)。DVT组采用下腔静脉狭窄法造模,造模后24小时获取小鼠下腔静脉组织。HE染色观察血栓形成情况；试剂盒检测SOD、MDA含量；Western blot法检测SIRT1蛋白的表达变化；DCFH-DA荧光探针捕获、流式细胞仪检测静脉壁组织中ROS含量。2.体外实验：①以0、100、200、400μmol/L浓度的H2O2分别处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)4、12、24小时,MTT法检测细胞活力,以明确H2O2最适损伤浓度及时间。②以10、20、30μmol/L浓度的SIRT1激动剂预处理HUVECs 2h后,将其暴露在200μmok/L的H2O2中24h, MTT法检测细胞活力,以明确SIRT1对HUVECs氧化损伤的保护作用及其最适浓度。③以30pmol/L浓度的SIRT1激动剂预处理HUVECs 2h后,将其暴露在200pmol/L的H202中24h,DCFH-DA荧光探针捕获、激光共聚焦显微镜观察,双氢罗丹明123(DHR123)染色、流式细胞仪技术检测细胞内ROS含量,以明确SIRT1的抗氧化作用。原位末端标记(TUNEL)法、AnnexinV/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot检测Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白的表达变化,以明确SIRT1抑制氧化应激诱导HUVECs凋亡的作用。④将HUVECs暴露在200μmol/L的H202中,在0、15min、30min、1h、2h、 3h、4h、8h时Western blot检测PI3-K/Akt、MAPKs通路关键蛋白的表达变化,以明确氧化应激反应中关键信号通路蛋白随时间的变化情况。⑤以30μmol/L的SIRT1激动剂预处理HUVECs2h后,将其暴露在200μmol/L的H2O2中,4h后Real-time PCR、Western blot检测SIRT1、 PI3-K/Akt/GSK3p、 MAPKs、NF-κB、Nfr2/ARE信号通路关键基因、蛋白的表达变化,以探讨氧化应激介导内皮细胞损伤凋亡的信号转导通路及SIRT1的调控作用。3.体外实验：①免疫荧光标记,荧光显微镜观察SIRT1蛋白在]HUVECs细胞中的定位情况。②以10、20、30μmol/L浓度的SIRT1激动剂预处理HUVECs2h后,将其暴露在200μmol/L的H2O2中,24h后Western blot检测P-Selectin. PSGL-1、vWF、TM蛋白的表达变化,以探讨SIRT1对内皮细胞分泌促血栓形成分子的调控作用及其浓度依赖效应。③以30pmol/L的SIRT1激动剂预处理HUVECs 2h,加或不加SIRT1特异性抑制剂EX527,将其暴露在200pmol/L的H202中,24h后Real-time PCR、Western blot检测P-Selectin. PSGL-1、vWF、TM基因和蛋白的表达变化,以验证SIRT1调控内皮细胞分泌促血栓形成分子,影响DVT形成的作用及机制。[结果]1.DVT组死亡率0%、成栓率83.3%、狭窄率96.05%±0.62%、残余管腔横截面积百分比3.95%±0.62%、血栓长度5.57±0.32mm、血栓湿重0.013±0.009g、下腔静脉直径1.52±0.03mm。SIRT1、SOD、MDA和ROS的表达在正常组与假手术组相比较均无统计学差异(P0.05)。DVT组静脉壁组织超氧化物歧化酶(SOD)的含量显著低于正常组和假手术组,丙二醛(MDA)的含量显著高于正常组和假手术组(P0.05)。DVT组SIRT1蛋白的表达低于正常组和假手术组(P0.05)。DVT组静脉壁组织中活性氧(ROS)含量显著高于正常组和假手术组(P0.05)。2.①以0、100、200、400μmol/L浓度的H2O2分别处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)4、12、24小时,细胞活力显示出显著的的浓度与时间依赖性,随H202浓度的增加和干预时间的延长,细胞活力逐渐下降(P0.01),200μmol/L组和400μmol/L组各时间点OD值相比无统计学差异(P0.05),说明细胞活力下降至平台期,不随H202浓度的增加而下降。参考前期研究和经典文献结果,选取200μmol/L、24h为H202最适干预浓度和时间。②以10、20、30μ mol/L浓度的SIRT1激动剂预处理HUVECs 2h后,细胞活力逐渐恢复(P0.05),并显示出一定的浓度依赖性,随SIRT1激动剂浓度的增加,细胞活力逐渐恢复(P0.05),因30μmol/L的SIRT1激动剂作用效果最显著,故选取30μmol/L为后续实验浓度。③以200μmol/L H2O2处理HUVECs 24h,细胞凋亡率、凋亡相关蛋白的表达(Bcl-2、Casepase-3)、胞内ROS含量显著增加(P0.05),而予30μmol/L的SIRT1激动剂预处理2h后,上述指标显著下降(P0.05)。④将HUVECs暴露在200μmol/L的H202中,磷酸化的蛋白—pAkt、p-c-Jun、pERK1/2、p-p38蛋白在30min时表达开始升高,至4-8h表达至峰值(P0.05),故选取4h为通路蛋白检测时间点。⑤以200μmol/L H2O2处理HUVECs 4h, c-Jun、 ERK1/2、p38、NF-κB、 Nrf2、GSK3β mRNA的表达上调(P0.05),Akt、SIRT1 mRNA的表达下调(P0.05)；p-c-Jun、pERK1/2、p-p38、NF-κB、Nrf2、GSK3β蛋白的表达上调(P0.05),pAkt、SIRT1蛋白的表达下调(P0.05)；而予30μmol/L的SIRT1激动剂预处理2h后,H2O2对以上基因和蛋白的调节作用被逆转(P0.05)。3.①SIRT1蛋白主要定位于细胞核中。②将HUVECs暴露在200μmol/L的H202中24h,P-Selectin、PSGL-1、vWF和TM mRNA和蛋白的表达显著上调(P0.05),而予30μmol/L浓度的SIRT1激动剂预处理2h后,H202对以上基因和蛋白的上调作用被逆转(P0.05)。③加入SIRT1特异性抑制剂EX527后,SIRT1对P-Selectin、PSGL-1、vWF和TM mRNA和蛋白的表达不再出现调控作用(P0.05)。[结论]1.氧化应激反应促进DVT发生、发展,PI3-K/Akt/GSK3β、MAPKs(c-Jun、 ERK1/2、p38)、NF-κB、 Nrf2/ARE信号通路参与氧化应激诱导的静脉内皮细胞损伤、凋亡。2. SIRT1通过抑制促凋亡通路(MAPKs)、抑制炎症反应通路(NF-κB)、激活抗凋亡通路(PI3-K/Akt/GSK3β)修复氧化应激诱导的内皮细胞损伤、凋亡。3.过表达SIRT1可抑制内皮细胞氧化损伤后促血栓分子P-Selectin、PSGL-1、 vWF和TM基因和蛋白的表达上调,推测其可能成为防治DVT形成的新的作用靶点。
【图文】：

实验操作,动物,毒理试验,澄明

麻醉试剂：异l#q<。异l#烧（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）为恩l#烧（Ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）的异构体，逡逑无色的澄明液体，易挥发，具有轻微气味。它通过动物呼吸吸入肺内进入血管，逡逑经血液循环到达大脑，抑制中枢神经系统，可达到止痛和无意识的双重功效。异逡逑l#烧比恩l#q<更少经过生物转化，几乎完全由肺清除。这意味着它对肝药酶系统逡逑的诱导很小，，因此对药代试验和毒理试验干扰最小。加上诱导和复苏均较快，异逡逑氛q<在动物实验中日趋广泛应用。逡逑

示意图,麻醉机,配件,示意图

ｙ焌逦＾Ｈｋ逦Ｉ逡逑Ｋ逦ＳＨｖ逡逑图１动物气体麻醉系统及实验操作台逡逑巧ｇ．ｌ邋Ａｎｉｍａｌ邋ａｎｅｓ化ｅｔｉｃ邋ｇａｓ邋ｓｙｓ化ｍ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｗｏｉ＂ｋ邋ｓｔａｔｉｏｎ逡逑麻醉试剂：异l#q<。异l#烧（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）为恩l#烧（Ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）的异构体，逡逑无色的澄明液体，易挥发，具有轻微气味。它通过动物呼吸吸入肺内进入血管，逡逑经血液循环到达大脑，抑制中枢神经系统，可达到止痛和无意识的双重功效。异逡逑l#烧比恩l#q<更少经过生物转化，几乎完全由肺清除。这意味着它对肝药酶系统逡逑的诱导很小，因此对药代试验和毒理试验干扰最小。加上诱导和复苏均较快，异逡逑氛q<在动物实验中日趋广泛应用。逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.6

【参考文献】