姜黄素-NO小分子水凝胶治疗小鼠心肌梗死

发布时间：2019-11-14 05:41

【摘要】：研究背景近年来,随着人们生活方式和饮食结构的改变,以及人口老年化的发展,心血管疾病已成为威胁人类健康的首要杀手。其中,心肌梗死(myocardial infarction,MI)是世界上致死率和致残率最高的疾病之一。MI后,心肌细胞发生不可逆性死亡,引起MI区非收缩性瘢痕形成、胶原沉积和细胞外基质降解,共同引起心脏形态、结构和功能的非适应性改变,称之为心室重构。心室重构会逐渐发展为心力衰竭(heart failure,HF),大大增加MI患者的再住院率和死亡率。近几十年来,随着心脏组织工程和再生医学的迅速发展,心肌内可注射性生物材料,比如水凝胶,展现出良好的心脏组织修复和促血管再生能力。姜黄素(curcumin,Cur)是一种是从姜科植物提取的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等药理作用。研究证明,姜黄素可抑制压力负荷或MI所致的心室重构,并可改善心功能。然而姜黄素的水溶性差和生物利用度低等缺点制约其临床的应用。一氧化氮(nitric oxide,NO)作为生物体内一种重要的气体信号分子,具有舒张血管、增加冠脉血流量、抑制血小板聚集和促进血管再生等多重心血管保护作用。但是NO分子极其不稳定,半衰期短,几秒内失活,严重制约其临床应用。目前,已经研发出不少具有高效率地产生和释放NO的生物材料,具有促进皮肤伤口愈合、改善下肢缺血和促进心肌梗死后血管再生等治疗作用。近年来,不少研究表明在缺血性心脏病的治疗方面,多种药物联合治疗比单药疗效更显著。因此,研究和制备可控制地释放姜黄素和NO的小分子水凝胶,一方面提高姜黄素的水溶性和治疗效果·,另一方面,水凝胶可提供力学支撑来改善MI后心功能;最后,姜黄素和NO联合治疗的效果可能具有协同效应。研究目的制备并评价能在β-半乳糖苷酶(β-gal)催化下释放一氧化氮的姜黄素—NO小分子水凝胶,并观察心肌内注射水凝胶对心肌梗死后小鼠的心功能、心室重构、心肌细胞凋亡及血管新生的影响,并初步探讨其作用机制。研究方法前期实验已分别合成带有姜黄素的水凝胶前体化合物Ⅰ(Cur-FFE-ss-ERGD)和带有NO供体的水凝胶前体化合物Ⅱ(Nap-FFGGG-NO)。现把两者按一定的摩尔比例(化合物Ⅰ:化合物Ⅱ=4:1)混合后并溶于PBS溶液,加热冷却后再加入谷胱甘肽还原剂(GSH),可通过共组装的方式形成黄色半透明的姜黄素-NO小分子水凝胶(Gel)。流变仪检测Gel的力学性能,高分辨透射电镜(TEM)检测超微结构,液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测姜黄素从Gel中的释放,在给予200 U/L的半乳糖苷酶的情况下,用一氧化氮检测试剂盒检测N0的重Gel中的释放。通过结扎雄性C57/BL6小鼠左前降支冠状动脉构建急性心肌梗死模型,并随机将其分为3小组,saline组:MI周边注射20 μL生理盐水和尾静脉注射50 μl生理盐水;Gel组:MI周边注射20 μL水凝胶和尾静脉注射50μl生理盐水;Gel+ β-gal组:MI周边注射20 μ L水凝胶和尾静脉注射50 μ 1浓度为0.4mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液。此外,还设有假手术组(sham组),开胸和穿线,但不结扎冠状动脉,不给予任何溶液或药物治疗。4周后,超声心动图检测心功能,包括射血分数(EF)、缩短分数(FS)、左室舒张末内径(LVIDd)和左室收缩末内径(LVIDs),其中心电图(ECG)结果也被记录下来;然后处死小鼠,迅速取出心脏标本并固定,切成薄片。Masson染色观察心脏结构和心肌纤维化程度;组织Tunel染色观察心肌细胞凋亡程度;vWF免疫荧光观察新生血管密度,免疫组织化学染色观察心脏组织SIRT1、TGFβ 1和MMP-2表达情况,并每组取出3只新鲜小鼠的心脏组织,研碎后行Western Blot定量分析SIRT1、TGFβ 1和MMP-2蛋白的表达。实验结果1.水凝胶的性能:水凝胶外观呈黄色果冻状,含有浓度为0.5wt%的化合物I和0.17wt%的化合物II。它可在室温下稳定保存至少一个月。TEM提示水凝胶为三维(3D)网状的微观形貌,由直径大约为20-80 nm的纳米纤维缠绕交织成网络状结构并包裹大量水分子而形成水凝胶。流变仪的频率扫描(frequency sweep)和张力扫描(strain sweep)均提示弹性模量(G')与粘性模量(G'')的比值是一个数量级以上,说明水凝胶的真正形成,具有较强的弹性和抗压性;水凝胶可通过酯键的水解释放出姜黄素单体,在常温下前24小时的累积释放量大约为2.43 μg/mL,占总量的0.84%,说明水凝胶具有持续缓慢释放能力。水凝胶在PBS溶液只缓慢释放姜黄素,给予200 U/L的β-半乳糖苷酶后,可检测到N0释放,前48小时的最大累计释放量占总量的26.14%,且保持低浓度缓慢释放状态,而不加酶的情况,始终检测不到N0的释放,说明水凝胶可控性释放N0。2.超声心动图结果:心梗模型各组心电图显示明显的病理性Q波形成,而非心梗组呈正常的qRs波,表明心肌梗死模型的成功建立(已形成陈旧性心肌梗死)。与sham组相比,saline组、Gel组和Gel+-gal组的心功能指标FS、EF显著降低(P0.01),而LVIDd、LVIDs明显升高(P0.05);与saline组比较,Gel组和Gel+β-gal的FS、EF均升高,LVIDd、LVIDs降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与Gel组比较,Gel + β-gal组FS、EF明显升高,LVIDd、LVIDs 明显降低(P0.05)。3.Masson染色结果:sham组心脏左室腔大小及几何形态正常,有极少量纤维化,而saline组左室腔明显离心性扩大,心室壁明显变薄,纤维化面积明显增加(P0.01);与saline组相比,Gel组和Gel+ β-gal组室壁厚度有所增加,左室腔变小,纤维化面积减少(P0.01);其中,与Gel组比较,Gel+β-gal组心脏形态更接近正常,纤维化程度更轻(P0.05)。4.心肌细胞凋亡结果:通过Tunel染色提示,sham组心肌细胞排列非常规整,凋亡阳性心肌细胞的百分比率非常低,而在saline组心肌细胞排列十分紊乱,凋亡率异常升高,两者差异具有统计学意义(P0.01)。Gel组经姜黄素治疗后凋亡率明显降低,与saline组比较差异具有统计学意义(P0.05)。在Gel+ β-gal组,细胞排列接近正常,凋亡率明显低于Gel组(P0.05)。5.心梗区血管新生情况:与sham组比较,saline组和Gel组血管新生增加,但差异无统计学意义(P0.05),而在Gel+β-gal中,新生血管密度明显增加约是其他组两倍,与其他三组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。6.心肌组织蛋白表达情况:通过组织免疫化学染色和心脏组织Western Blot检测提示,与sham组比较,saline组的SIRT1表达降低(P0.05),而TGFβ1和MMP-2表达增加(P0.05);与saline组相比,Gel组和Gel+β-gal组均可增加SIRT1表达(P0.05),降低TGFβ 1和MMP-2表达(P0.05)。与Gel组相比,Gel +β-gal组更明显增加SIRT1表达,降低TGFβ 1和MMP-2表达(P0.05)。结论1.成功制备姜黄素-NO小分子水凝胶,具有良好力学性能,自身可缓慢释放出姜黄素,而只有额外添加β-半乳糖苷酶才可释放NO,具有可控性和缓释效果。2.姜黄素-NO小分子水凝胶可明显改善小鼠心肌梗死后心功能,减轻心肌纤维化,减轻细胞凋亡和促进血管新生。当水凝胶同时释放姜黄素和NO时,其治疗效果比单独释放姜黄素的更好,说明姜黄素与NO在小鼠心肌梗死治疗上具有协同效应。3.姜黄素和NO的协同的心脏保护效应的潜在分子机制可能与提高SIRT1表达,降低TGFβ1和MMP-2的表达有关。
【图文】：

图１邋Ａ）化合物Ｉ及化合物ＩＩ的结构式，Ｂ）邋（Ｉ）为化合物Ｉ的溶液，（ＩＩ）逡逑为化合物ＩＩ的混悬液，（ＩＩＩ）为姜黄素－ＮＯ小分子水凝胶，Ｄ）水凝胶的ＴＥＭ微逡逑观结构（Ｂａｒ＝０．邋５邋ｕ邋ｍ）。逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ａ）邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋ＩＩ，，邋Ｂ）邋ｏｐｔｉｃａｌ逡逑ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋（Ｉ），ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ邋（ＩＩ）邋ａｎｄ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋（ＩＩＩ），邋Ｄ）ＴＥＭｏｆ逡逑ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋（Ｂａｒ＝０．邋５邋ｗｍ）．逡逑３．１姜黄素－ＮＯ小分子水凝胶的配制及特点逡逑如图１邋Ａ）及Ｂ）所示，根据前期的实验研究，化合物Ｉ结构为Ｃｕｒ－ＦＦＥ－ｓｓ－ＥＲＧＤ，逡逑姜黄素通过酯键连接到多肽ＦＦＥ－ｓｓ－ＥＲＧＤ上，此多肽通过二硫键（－ｓｓ－）把亲水逡逑端ＥＲＧＤ多肽序列和疏水端Ｃｕｒ－ＦＦＥ序列连接起来。其中Ｆ为苯丙氨酸，具有苯逡逑环结构，通过苯环的折叠的物理作用，具有促进成胶的能力。图Ｂ中的Ｉ逡逑所示，化合物Ｉ在ＰＢＳ溶液中水溶性很好，成黄色透明的溶液状态，水溶性可达逡逑１０ｍｇ／ｍｌ（１０ｗｔ％）。通过加入４当量的还原性谷胱甘肽把二硫键断开，化合物Ｉ逡逑在ＰＢＳ中的水溶性突然降低，就会自组装成单独的姜黄素水凝胶［５５］（图中未给出逡逑单独的姜黄素水凝胶的图片）。该单纯的姜黄素水凝的最低成胶浓度为０．５邋ｗｔ％逡逑（０．邋５ｍｇ／ｍｌ）。化合物ＩＩ结构为Ｎａｐ－ＦＦＧＧＧ－ＮＯ，由带有半乳糖基团保护的亲核逡逑

Ａ）和在１邋ｒａｄ／ｓ的频率下的张力扫描Ｂ），其中方形的点代表弹性模量（Ｇ’）和逡逑圆点代表粘性模量（Ｇ’邋’）；邋Ｃ）代表姜黄素从水凝胶释放到（３７°邋Ｃ，ｐＨ＝７．４）逡逑的ＰＢＳ溶液中的累积释放量；Ｄ）４８小时内，在给予浓度为０．邋２邋Ｕ／ｍｌ的半乳糖甘逡逑酶催化下的ＮＯ累积释放量与总量的比例。逡逑Ｆｉｇ２邋Ａ）邋ａｎｄ邋Ｂ）邋Ｄｙｎａｍｉｃ邋ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ邋ｓｗｅｅｐ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｏｆ邋１％邋ａｎｄ邋ｓｔｒａｉｎ逡逑ａｔ邋ｔｈｅ邋ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ邋ｏｆ邋１邋ｒａｄ／ｓ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｆｏｒｍｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋２邋ｈｏｕｒｓ邋ａｔ邋３７邋０邋Ｃ逡逑（ｔｈｅ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｓｙｍｂｏｌｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ邋（Ｇ＊邋）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｐｈｅｒｅ邋ｏｎｅｓ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ邋（Ｇ’邋Ｊ邋），邋Ｃ）邋Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｒｅｌｅａｓｅ邋ａｍｏｕｎｔ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ逡逑ａｔ邋３７°邋Ｃ邋ｉｎ邋ＰＢＳ邋ｂｕｆｆｅｒｓ邋（ｐＨ邋＝邋７．邋４）邋ｆｒｏｍ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈｏｕｒｓ，邋Ｄ）邋Ｔｈｅ逡逑ｒｅｌｅａｓｅ邋ｐｒｏｆｉｌｅ邋ｏｆ邋ＮＯ邋ｆｒｏｍ邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋０．２邋Ｕ／ｍｌ逡逑０－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ邋ｆｏｒ邋ｏｖｅｒ邋４８邋ｈｏｕｒｓ．逡逑３．邋４药物从小分子水凝胶中释放的结果逡逑３．４．１姜黄素的释放结果逡逑根据己知姜黄素单体浓度及ＬＣ－ＭＳ对应的峰面积，用ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ邋９．邋０做出标逡逑准曲线为Ｙ＝ｌ．邋２４ｘｌ０８Ｘ＋３６７４２８．邋４２．在图２邋Ｃ中看出，因姜黄素是通过
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R542.22


本文编号：2560677