心肌梗死后心力衰竭microRNA表达谱分析及功能探究

发布时间：2020-02-02 01:26

【摘要】：心力衰竭（HeartFailure，HF）是各种危重心血管疾病发展的终末阶段，HF确诊患者5年生存率仅为50%，被认为是危害人类健康的主要疾病之一。近年来国内外研究者普遍认为，HF的本质是一种分子-临床综合征，基因表达调控异常与HF的发病机制密切相关。microRNA（miRNA）是一类新发现的非编码内源性小单链RNA分子，主要作用是通过诱导靶基因沉默参与转录后水平的基因表达调控。特定miRNA的表达模式很大程度上取决于组织和细胞类型、代谢情况以及疾病状态。表观遗传学资料表明，miRNA参与HF的多个基本病理过程，如心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心肌肥厚和心脏重构等。由于标准化程序缺乏、病例数少以及不同病例间变异程度高等原因，人类衰竭心脏miRNA的研究在很大程度上受到限制。虽然如此，有研究者比较了人类与模型动物衰竭心脏miRNA表达谱，发现多数miRNA的表达模式呈现较好的一致性。因此，通过实验动物模拟不同病因的HF并进行miRNA表达谱分析，可以为miRNA在人类心衰发病机制中的研究提供有价值的参考。本研究采用结扎大鼠冠状动脉前降支的方法构建心肌梗死后HF模型，通过 Solexa高通量测序技术在全基因组范围内分别检测模型组及对照组左室心肌组织miRNA表达谱，分析模型组与对照组已知miRNA的表达差异并预测出新的miRNA。之后利用RNAhybrid软件预测差异表达miRNA的靶基因，并通过对差异miRNA的候选靶基因进行GO注释和KEGG通路分析，初步了解候选靶基因行使的主要生物学功能及参与的主要生化代谢途径和信号转导通路。此后，我们采用与测序相同的大鼠心肌样本进行实时荧光定量PCR验证miRNA测序的可靠性，并分别检测部分差异miRNAs（miR-31a-5p，199a-5p，122-5p和208a-3p）在术后4周、8周、10周心肌组织中的表达变化，了解差异miRNA在心梗术后不同时期的动态表达模式及其对心衰发展的可能作用。最后，我们通过化学合成的miRNAmimics和inhibitor改变心肌细胞内miR-31a-5p及miR-199a-5p的表达水平，初步探究miR-31a-5p及miR-199a-5p对AngII诱导的心肌细胞凋亡的作用。 结果： 1.采用开胸结扎冠状动脉前降支的方法成功诱导大鼠心肌梗死，通过对术后4周、8周、10周大鼠超声心动图、心脏肥厚指数、BNP及心肌病理形态学分析发现，术后随时间进展，模型组大鼠心功能进行性下降，不良心脏重构逐渐加重，心梗后10周已形成稳定心衰。 2.通过高通量测序成功构建对照组与心衰组左室心肌组织miRNA表达谱，共鉴定225种已知miRNAs，其中107种miRNAs表达水平在两组有明显差异，与对照组相比，79种miRNAs显著上调，28种miRNAs显著下调；两组表达量差异在2倍以上的miRNAs共有18种，其中16种表达量在心衰组显著上调，2种表达量在心衰组显著下调。 3.采用RNAhybrid软件对18个差异显著miRNAs进行靶基因预测，共得到31401个候选靶基因，针对这些预测靶基因进行GO及KEGG分析，并与参考基因组进行对比发现，差异miRNA的候选靶基因主要在信号通路、细胞通讯、信号转导、应激反应、细胞表面受体及细胞表面调控等GO条目显著富集，并鉴定出包括Wnt信号通路、VEGF信号途径、MAPK信号途径、细胞周期、II型糖尿病、Notch信号途径、血管平滑肌收缩等与心衰相关通路在内的36个显著富集的KEGG信号通路。 4.实时荧光定量PCR结果与测序结果一致，证实测序结果准确可靠。 5.心梗术后4周、8周、10周分别检测特定miRNA的表达水平发现，特定miRNA在心梗后心衰发展过程中呈现时间-依赖的表达模式：miR-199a-5p和miR-31a-5p在心梗术后随时间进展表达水平逐渐升高，提示其可能参与心衰的发病过程；miR-122-5p在心梗术后早期阶段表达水平无显著变化，但在形成稳定心衰后表达水平显著升高，提示miR-122-5p可能作为心衰潜在的生物标志物；而miR-208a-3p在心梗的早期阶段表达水平显著升高，之后逐渐下降，至术后8周时与对照组无明显差异，之后其表达仍继续下降，至术后10周时心衰组其表达水平显著低于对照组。这些数据表明特定miRNA很可能在心衰发展的不同时期发挥不同作用。 6.100nM的AngII作用于心肌细胞能够成功诱导心肌细胞凋亡；通过在AngII诱导的心肌细胞凋亡模型中过表达或抑制miR-199a-5p的水平发现，miR-199a-5p不仅能显著增加AngII诱导的心肌细胞凋亡，单独作用也能诱导心肌细胞发生凋亡，与之不同的是，miR-31a-5p仅能轻微增加AngII诱导的心肌细胞凋亡，，单独作用对心肌细胞凋亡的发生也无明显影响。 结论： 1.本研究共筛选出107种表达水平有明显差异的miRNAs，其中两组表达量差异在2倍以上的miRNAs有18种，为miRNA在心衰发病机制中的研究提供了依据； 2.明确了miR-31a-5p，199a-5p，122-5p及208a-3p在心梗后不同时期的动态表达模式，表明特定miRNA在心衰发展的不同时期其作用可能不同； 3.miR-199a-5p能够促进心肌细胞凋亡发生，抑制其表达有可能成为防止AngII诱导心肌细胞凋亡的有效方法。
【图文】：

于 70 岁 人 群 中 有 超 过 10 % 的 发 病 率[1 2] ， 此 外 ， 心 衰 确 诊 患 者 5 年 生 5 0% ，而 且 近 10 年来 心 衰的 发 病率 继 续升 高 [1 3] ，这 为 全球 带 来了 沉 重社 会 负担 。 因 此 ，各 国 的 研究 者 一 直着 眼 于 寻 求有 效 的 心衰 防 治 措 施 发 病 机 制 也 有 了 更 加 深 入 的 认 识 ： 从 20 世 纪 40 ~ 6 0 年 代 的 心 肾 学0 年代 的 血 流动 力 学 学 说 ，再 到 心循 环 学说 以及 90 年 代以 来 的 心 脏重 而 为 针对 其 发 病机 制 给 予 更有 效 的 防治 措 施 提 供了 理 论 依据 。 从本 质 衰 竭 是 一 种 分 子- 临 床 综 合 症 ， 心 衰 的 发 生 与 心 脏 的 功 能 、 神 经 激 素 分异 常 相关 ， 并伴 随结 构 和 形 态学 改 变 。心肌 的 初 始损 伤 可 能是 急 性 或 慢一 系 列由 包 括 心 肌细 胞 、 心 肌 成 纤 维细 胞 和 细 胞外 基 质 参与 、 通 过 一系 细 胞 和 分 子 途 径 激 活 的 初 始 代 偿 机 制 产 生 ， 此 时 如 果 不 给 予 适 当 干 预就 会 发生 不 良 重 构 ，并 最 终不 断 恶 化发 展 为 心 衰 。心 衰 的发 生 进 展 与心 本 病 理过 程 直 接 相关 ： 不 良心 室 重 构、 心 肌 细 胞肥 大 、 心 肌 细 胞 凋亡 和 图 1[1 4] ），这 些 过程 紧 密相 连 并 交织 在 一起 共 同 导致 心 衰的 不 断 恶化 。

疫 - 炎 症 通 路 和 细 胞 活 动 ， 促 进 梗 死 伤 口 愈 合 及 左 室 结 构 性 重 构 ， 这 些 病 理及 炎 症活 动 不 仅存 在 于梗 死 区域 ，也 存在 于 其余 存 活 心肌 中[1 5 -1 7 ] 。恢 复 阶段 室重 构 包 括 梗 死心 肌壁 的 变 薄和 扩 张 （梗 死 扩 张 ）； 在晚 期阶 段 ， 左 室重 构 于 存 活 心肌 的 结 构重 排 ， 这涉 及 心 肌细 胞 肥 大、 间 质 纤维 化 及 左室 扩 大 [1 8, 1心脏 在 心肌 缺 血 后的 愈 合及 修 复是 一 个 连续 和 重叠 的 复 杂过 程 [1 5 -1 7 , 2 0] ，该始 于 坏 死心 肌 被 肉 芽组 织 替 代的 炎 症 阶段 ，接下 来是 纤 维 发生 阶 段 并 伴随 瘢 织 生 成 。梗 死 区 的 愈合 依 赖 快速 严 格 的髓 样 细 胞 招募 ， 特 别是 单 核 细 胞的 协 化 ， 这 促进 细 胞 废 墟和 凋 亡 细胞 的 再 吸收 、 细 胞 外基 质 组 分的 降 解 、肉 芽 组 成 的 调 节以 及 新 生 血管 发 生 ，这 些 病 理过 程 是 通 过细 胞 因 子、 蛋 白 酶 及生 长 的 分 泌 实 现 的[ 2 0- 2 4] （ 图 2[2 5 ]）。 尽 管 从 动 物 模 型 中 能 够 了 解 心 肌 梗 死 后 恢 复细 胞 组 分随 时 间 在 心肌 组 织 中的 变 化 情况 ， 但是 至今 我 们 仅部 分 了 解 梗死 区 死 边 缘 区高 度 复 杂 的病 理 过 程 ，这里 不 同亚 型 的 侵 入性 髓 样 细胞 以 时 间依 赖 式 与 原位 组织 相 互作 用， 并 刺激 伤 口的 愈 合 。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.6;R542.22

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 朱文晖;张晓红;肖渊茗;;超声心动图评价心力衰竭大鼠模型心功能改变[J];中南大学学报(医学版);2009年05期

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1 滕宇;小鼠精原细胞与精母细胞miRNA差异表达及功能研究[D];北京协和医学院;2011年

2 张忱;大鼠癫痫持续状态后海马miRNA表达谱的研究[D];中南大学;2010年

本文编号：2575559