【摘要】：研究背景及目的心肌细胞对缺氧性损伤的耐受差,缺氧会导致心脏电活动的异常、心肌细胞坏死、细胞凋亡。包括冠状动脉粥样硬化性心脏病在内的各种缺血性心脏疾病均可导致心脏发生缺氧性损害,对抗缺氧造成的心肌损伤是心脏疾病的治疗目标之一。临床治疗心肌缺血缺氧多依赖药物进行有限的缓解,缺血缺氧导致的心功能损害亦不能得到足够改善,开展缺血缺氧心肌损害发生机制研究,寻找新的心脏功能修复策略是亟待解决的科学问题。血小板源性生长因子(Platelet derived growth factor, PDGF)是一种重要的生长因子,家族成员包括PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC及PDGF-DD。在生理状态下,PDGF贮存于血小板中,当组织受损时,存贮于内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等细胞中的PDGF亦会释放,其生物学特征主要促细胞分裂效应、趋化性和血管收缩效应,在PDGF家族中,PDGF-BB与心血管系统疾病的联系最为密切。PDGF可以诱导内皮细胞、血管平滑肌细胞的增殖与移行,是促血管新生和再生的生长因子。早期的研究发现PDGF主要促进血管内皮细胞的增殖,随后发现PDGF一些特定细胞类型的存活中扮演关键角色,参与到小鼠心尖切除后心脏的再生。同时,PDGF-BB可能通过有效促进梗塞后微血管新生进而减小心肌梗死面积。基于此,我们提出PDGF-BB可能是心肌细胞的保护因子。PDGF-BB能够刺激细胞分化和增殖。同时,缺氧可以增加PDGF-BB在血管内皮细胞中的表达。因此这些结果都提示了PDGF-BB可能是缺氧状态下心肌细胞中的重要分子。细胞凋亡是心功能障碍、心律失常、血流动力学障碍的细胞学基础,缺血缺氧可通过多条途径对心肌细胞的产生损伤,从而导致心肌细胞坏死或凋亡。体内外实验证实缺氧可以诱导细胞凋亡,PDGF-BB可能存在的有益心肌的作用是否是通过阻止细胞凋亡实现的尚不明确。因此,需要明确心肌细胞缺氧后内源性PDGF-BB的变化规律,从而进一步探讨PDGF-BB对于在缺氧条件下体外培养心肌细胞保护作用。目前,通过基因转导技术使PDGF-BB在细胞内高表达已有报道,但表达效率仍需改进。基因转导技术是将纯化的外源目的基因转移到细胞内,表达具有生物学功能的蛋白。病毒载体法是目前最有效的基因导入方式,其中,逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和人单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)载体是常见的病毒载体等。腺病毒的优点在于包装量比较大,外源基因不会插入细胞基因组内。缺点是有较高的免疫原性,包装周期较长。慢病毒载体属于反转录病毒载体,是由人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)发展而来,优点在于它能够感染多种难感染的细胞,缺点靶基因表达的不可控性,限制了其在体内的应用。HSV是与人类共存的一种病毒,其中Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)是一种基因组为152 kb的双链线状DNA病毒,其中84个已知基因中有一半是非必须基因,这些基因允许删除,可以插入内含子和调节序列,因此HSV-1载体可容纳长达30Kb的外源基因,可改造为病毒载体。由于HSV-1具有高度的易感性,其宿主细胞广泛,能感染分裂期或非分裂期细胞,是较为理想的载体,用于转基因载体治疗人类疾病有良好的应用前景。第一部分缺氧对心肌细胞血小板源性生长因子-BB的表达调控目的：观察原代培养SD乳鼠心肌细胞的缺氧损伤,研究缺氧前后PDGF-BB在基因水平和蛋白水平上的表达变化,初步探讨缺氧诱导心肌细胞凋亡过程中PDGF-BB的变化规律。方法1.原代心肌细胞培养及心肌细胞缺氧模型的建立取新生2-3天乳鼠心室肌0.1%胰酶和0.16%Ⅱ型胶原酶进行混合消化法进行心肌细胞体外培养,随机将培养的心肌细胞分为四组：正常组(NC)、缺氧组3h组(H3h)、缺氧6h组(H6h)和缺氧12h组(H12h)。其中缺氧组将心肌细胞置于培养箱中进行缺氧,设置条件为37℃,95%N2和5%CO2分别缺氧3h、6h和12h。2.本缺氧模型对心肌细胞造成的缺氧损伤观察缺氧后心肌细胞的生长情况,建立缺氧模型后通过检测各组心肌细胞乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)水平评价细胞的损伤情况。使用TUNEL(脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记)试剂盒测定各组心肌细胞的凋亡情况。3. PDGF-BB在缺氧后心肌细胞中的表达变化采用免疫荧光技术确定PDGF-BB在细胞内的定位表达,采用实时定量PCR的方法探究(Q-PCR)在缺氧损伤后PDGF-BB基因水平的表达变化；采用免疫蛋白印迹研究缺氧条件下PDGF-BB蛋白的表达变化。4.数据分析用实验数据均选用SPSS 17.0统计软件分析,数据用均数+标准差(Mean ±SD)表示。各实验至少独立重复3次。若方差齐用t检验,方差不齐用秩和检验,多组间的比较用方差分析,p0.05显示有统计学差异。结果在现象研究层面,本部分主要得到了以下研究结果：1.本实验中体外培养心肌细胞纯度达98%以上。常氧条件下,心肌细胞生长状态良好,细胞饱满。缺氧后心肌细胞膜皱缩,胞质颗粒增加,足突减少甚至消失,细胞搏动无力且不规律。2.LDH水平检测结果显示随缺氧时间的延长,细胞培养上清的LDH值呈增加趋势,缺氧12h组LDH较常氧组显著增高,差异有统计学意义(p0.05)。TUNEL法检测心肌细胞凋亡率结果显示随缺氧时间的延长,凋亡率呈逐渐增加趋势,缺氧12h组心肌细胞凋亡率较常氧组显著升高,差异有统计学意义(p0.05)3.实时定量逆转录PCR (Q-PCR)结果显示：缺氧12h组PDGF-BB mRNA的表达量较常氧组明显升高,差异有统计学意义((p0.05)4.蛋白免疫印迹(WB)结果显示：缺氧后12h组心肌细胞PDGF-BB蛋白较常氧组显著增加,差异有统计学意义((p0.05)。第二部分血小板源性生长因子BB在心肌细胞缺氧损伤过程中的作用机制目的构建人单纯疱疹病毒-1 (HSV-1) PDGF-BB干扰基因重组体(NX01-U6H1-rPDGFi),确定转导效率,转导心肌细胞后缺氧培养,观察PDGF-BB基因敲减对缺氧诱导的心肌细胞损伤凋亡的影响,探究内源性PDGF-BB在心肌细胞缺氧损伤中的作用。构建HSV-PDGF-BB过表达重组体(HSV-CMV-PDGF),转导心肌细胞后缺氧培养,观察过表达PDGF-BB蛋白对缺氧诱导的心肌细胞损伤凋亡的影响,进一步明确PDGF-BB对心肌细胞缺氧损伤的保护作用,同时测定PI3K、AKT、ERK等信号通路蛋白,了解可能存在的信号通路机制方法1.人单纯疱疹病毒-1重组病毒的构建为了进一步研究PDGF-BB在心肌细胞缺氧中的作用,我们随后采用RT-PCR方法扩增PDGF-BB基因,同时根据PDGF-BB基因CDS设计两条shRNA(短发卡RNA)序列,克隆HSV-PDGF-BB过表达载体,构建HSV-PDGF-BB干扰RNA重组体。过表达及干扰RNA重组体构建成功后将其转导培养的心肌细胞缺氧处理,WB检测PDGF-BB的表达水平。2.过表达及低表达PDGF-BB表达对心肌细胞凋亡的影响心肌细胞分为五组,常氧组(NC组)、单纯缺氧组(H组)、缺氧+空载体组(H+vector组)、缺氧+PDGF-BB过表达组(H+PDGF-BB组)、缺氧+PDGF-BB低表达组(H+SiPDGF-BB组)。比较各组的LDH水平及凋亡率,判断过表达及低表达PDGF-BB对心肌细胞凋亡的影响。3.过表达PDGF-BB调控心肌细胞凋亡的机制研究免疫印迹法检测缺氧前后PI3K、Akt、磷酸化Akt、ERK、磷酸化ERK在蛋白水平的表达情况,比较各组之间的差异,探讨过表达PDGF-BB调控缺氧心肌细胞凋亡的信号通路变化。4.数据分析用实验数据均选用SPSS17.0统计软件分析,数据用均数+标准差(Mean ±SD)表示。各实验至少独立重复3次。若方差齐用t检验,方差不齐用秩和检验,多组间的比较用单因素方差分析,p0.05显示有统计学差异。结果在功能研究层面,本部分得到以下结果：通过酶切和PCR鉴定证明成功构建了HSV-PDGF-BB过表达及干扰RNA重组体；HSV-1病毒载体转导心肌细胞效率为80%。HSV-PDGF-BB过表达载体转导心肌细胞后缺氧培养PDGF-BB表达水平较空载体明显增加(p0.05),心肌细胞过表达PDGF-BB;而HSV-PDGF-BB干扰载体转导细胞后缺氧培养PDGF-BB表达水平较空载体明显下调(p0.05),心肌细胞低表达PDGF-BB.2.为了明确内源性PDGF-BB在缺氧心肌细胞中的作用,我们对培养的心肌细胞进行了PDGF-BB基因敲减后缺氧培养。结果表明,缺氧+PDGF-BB低表达组心肌细胞凋亡率及心肌细胞培养上清LDH的水平较单纯缺氧及缺氧+空载体组显著增加(p0.05),PDGF-BB基因敲减加重了缺氧损伤。3.为进一步研究PDGF-BB对缺氧诱导心肌细胞凋亡的影响,空载体及HSV-PDGF-BB过表达载体转导心肌细胞后缺氧,缺氧+PDGF-BB过表达组心肌细胞凋亡率及心肌细胞LDH的水平较单纯缺氧及缺氧+空载体组显著较少(p0.05), PDGF-BB基因过表达修复了缺氧损伤。4.心肌细胞缺氧后,过表达PDGF-BB组PI3K、磷酸化AKT蛋白水平较单纯缺氧组、缺氧+空载体组增高(p0.05),而磷酸化ERK蛋白水平无变化(p0.05),PI3K/AKT细胞通路可能参与调控PDGF-BB对心肌的保护作用。结论1.本实验结果表明缺氧可诱导心肌细胞损伤凋亡,在这个过程中伴随着PDGF-BB表达的增加。2.本实验结果证实PDGF-BB具有抗缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用。3.本研究结果提示PDGF-BB可能是通过调节PI3K-AKT信号通路来影响缺氧诱导的心肌细胞凋亡,这对PDGF-BB干预治疗心肌缺氧提出了新策略。
【图文】：
图１也肌细胞缺氧后细胞形态学变化常氧组屯、肌细胞形态饱满，折光率好，逡逑呈现圆形、楠圆形、多角形、不规则形状；缺氧后屯、肌细胞膜皱缩，足突减少逡逑
图２缺氧前后也肌细胞培养液乳酸脱氨酶水平变化随缺氧时间培养上清的ＬＤＨ值呈增加擅势，Ｈ１化姐较ＮＣ组明显升高，差异（；？＜０．０５）。０５邋ＶＳ邋常氧对照。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
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