胞内HMGB1调控EAM小鼠心肌浸润Mφ极化的机制研究

发布时间：2020-03-21 16:19

【摘要】：目的利用Ad-HMGB1-shRNA体外下调巨噬细胞内高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box 1,HMGB1),观察HMGB1作为DNA分子伴侣,参与并调控巨噬细胞极化的过程,初步研究其潜在的分子机制,通过构建实验性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis,EAM)小鼠模型,阐明胞内HMGB1在EAM发生、发展进程中,对浸润心肌组织的巨噬细胞极化的调控机制。方法(1)筛选干扰片段:设计三条干扰序列,构建并包装重组腺病毒,体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,于对数期时进行转染,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测三组重组腺病毒的转染效率。(2)胞内HMGB1对巨噬细胞极化及抗原加工提呈能力的影响:进行成功转染后,利用Western Blot检测LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)蛋白水平;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养上清炎症介质分泌量;于体外单染CD86和MHCⅡ分子后,用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测巨噬细胞抗原加工提呈能力。(3)胞内HMGB1对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,ANG II)诱导的巨噬细胞极化的影响:Ad-HMGB1-shRNA成功下调胞内HMGB1,ANG II体外作用12h,利用Western Blot检测各组细胞中iNOS蛋白表达水平;FCM检测抗原加工提呈的变化;ELISA测定细胞上清液中M1型相关因子的分泌情况。(4)胞内HMGB1影响巨噬细胞极化的分子机制:成功下调胞内HMGB1后再给予ANG II刺激细胞30 min,利用Western Blot检测核转录因子KappaB(nuclear transcription factor KappaB,NF-κB)、蛋白激酶ERK1/2、P38的磷酸化水平。(5)重组AAV感染EAM小鼠模型的构建:将3周龄的雄性BALB/c小鼠分为Control组(野生组)、EAM+AAV-HMGB1组(实验组)、EAM+AAV-Ns组(阳性对照组),小鼠尾静脉注射病毒悬液,每10天注射一次,共计两次。利用制备的抗原肽免疫小鼠,建立EAM模型。41天后建模结束,取出小鼠骨髓来源巨噬细胞,倒置荧光显微镜观察荧光表达情况,确定感染效率。(6)AAV-HMGB1对EAM小鼠心肌组织炎症的治疗:将取出的心脏送往医院病理科,将进行心肌组织切片后,进行HE染色和病理评分;ELISA测定血清中炎症因子分泌变化;免疫荧光检测EAM小鼠心肌组织中F4/80~+CD86~+巨噬细胞浸润的情况。结果(1)重组腺病毒可明显下调巨噬细胞HMGB1蛋白水平以及mRNA水平,转染效率达90%以上。(2)Western Blot结果显示:成功下调胞内HMGB1后,实验组iNOS蛋白表达量明显少于对照组。ELISA显示实验组炎症因子分泌减少,且与对照组相比有统计学差异(P0.05)。通过FCM检测发现,实验组巨噬细胞抗原加工提呈能力亦受到抑制。(3)Western Blot、ELISA和FCM检测结果显示:下调胞内HMGB1后可减少iNOS、炎性介质以及CD86、MHCⅡ分子的表达,即可有效逆转ANG II所诱导的巨噬细胞向M1型极化。(4)预先成功下调巨噬细胞内HMGB1后,再以ANG II进行作用,与对照组相比,NF-κB、ERK1/2、P38分子磷酸化水平均呈现下降趋势,实验重复三次,均有统计学意义。(5)成功构建重组AAV感染的EAM小鼠模型。(6)AAV-HMGB1进行治疗后,EAM小鼠心肌组织病理评分、血清中炎性因子分泌、F4/80~+CD86~+M1型巨噬细胞浸润均显著低于对照组。结论(1)体外运用Ad-HMGB1-shRNA下调巨噬细胞内HMGB1能有效逆转巨噬细胞向促炎的M1型极化,减少炎症介质分泌,此过程依赖于转录因子NF-κB、蛋白激酶ERK1/2、P38信号分子通路进行调控。(2)AAV-HMGB1可显著减少实验性自身免疫性心肌炎小鼠心肌组织中F4/80~+CD86~+巨噬细胞浸润、降低血清中炎性因子含量,进而缓解心肌炎症的发展,对疾病起到一定治疗作用。
【图文】：

巨噬细胞

江苏大学硕士学位论文同状态间的动态转换，当炎症过强时，则易诱发多种自身免疫用过强，则无法有效清除病原体。因此正常的机体需要维持巨衡[27-29]。的疾病微环境下，M1、M2巨噬细胞会表达出不同的功能表型我们将在M1巨噬细胞中特异高表达的基因群称为M1基因群，在高表达的基因群称为M2基因群。这些特异基因群的表达产物2型的标志分子。M1型的标记分子较多，，有iNOS、 IL-6、TNF-的标记物主要有Arg-1、CD206等。M1型和M2型巨噬细胞是极，因此巨噬细胞的可塑性还有待进一步的研究与探讨[30, 31]。

功能图,功能,核小体,核染色质

染色质的能力不同，独立的功能结构域已可捆绑 DNA 共价键的形式连接时这种捆绑功能将大大增强[63, 64]。核内核染色质捆绑位点上存在着竞争关系，在受到外界刺激时替代 H1 对核染色质的捆绑作用，HMGB1 捆绑核小体后、重构染色质结构。并且 HMGB1 是目前发现的最活跃要 1-2 s 即可穿过细胞核，这意味着 HMGB1 的这种绑定1 可在短暂的时间内重构核染色质结构，增强相应 DNA 时靶位点处发生均等的弯曲，这种高度浓缩的超分子结序列被进一步暴露，进而核内许多生物活性的蛋白质被修复蛋白、转录激活因子、共抑制因子和许多转录因子：NF-κB/Rel 家族、p53/p73 等[65-67]。因此细胞内 HMGB体相互作用替代了组蛋白 H1 使得核小体重塑，增强核小的亲和性，诱导转录的发生，调控相应性状的表达。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

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