尼古丁对血管内皮细胞自噬作用机制的研究

发布时间：2020-03-21 18:16

【摘要】：目的:吸烟作为心血管损伤的独立危险因素严重危害人体健康。本实验通过体外研究尼古丁对血管内皮细胞的影响而模拟在体吸烟对心血管损伤的模型,进而探讨尼古丁引起血管内皮细胞的损伤机制,通过明确尼古丁对自噬流及凋亡的影响进而揭示尼古丁与血管内皮细胞功能紊乱之间的关系。方法:用尼古丁干预体外培养的人脐静脉内皮细胞,模拟在体吸烟模型。1.检测尼古丁对血管内皮细胞凋亡和自噬的影响,将HUVECs随机分组:空白对照组、尼古丁组(6×10~(-6) M)/氯喹组(CQ)和氯喹与尼古丁组(CQ+NIC),采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3及自噬小体标志物LC3Ⅱ和自噬相关蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表达水平;采用流式细胞术检测血管内皮细胞凋亡率。2.检测尼古丁抑制自噬的信号通路,将HUVECs随机分为五组:空白对照组、尼古丁组(15 min、30 min、60 min)、α7nAChR基因沉默组(α7nAChR siRNA+NIC),采用Western Blot方法检测AMPKα和ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平;使用AMPKαsiRNA和ERK1/2/p38 MAPK抑制剂后,采用Western Blot方法检测SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表达水平。3.检测ROS是否抑制自噬流自噬小体的清除,将HUVECs随机分为三组:对照组、尼古丁组(NIC)、α7nAChR基因沉默组(α7nAChR siRNA+NIC)/ROS清除剂组(NAC+NIC),采用流式细胞术检测细胞内ROS的生成;采用Western Blot方法检测细胞内SQSTM1/p62、LAMP2蛋白表达水平。结果:1.尼古丁通过增加cleaved caspase-8(外源性凋亡途径)和cleaved caspase-3的活化及细胞凋亡率,进而促进HUVECs凋亡;尼古丁通过减少Beclin-1和LAMP2、增加LC3Ⅱ、SQSTM1/p62的蛋白表达,进而主要抑制自噬流自噬小体清除,使细胞内自噬流受阻。与空白对照组相比,尼古丁处理后cleaved caspase-9(线粒体凋亡途径)蛋白表达无统计学差异(P0.05),cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白表达都显著增加(P0.01),细胞凋亡率也与cleaved caspase-3有相同的变化趋势(P0.01)。与空白对照组相比,自噬小体标志物LC3Ⅱ蛋白表达水平在尼古丁处理后增加(P0.01)。氯喹处理后LC3Ⅱ蛋白表达显著增加(P0.01),而氯喹预处理后尼古丁引起的细胞内LC3Ⅱ蛋白表达并没有进一步增加(P0.05);尼古丁组中SQSTM1/p62的蛋白表达与LC3Ⅱ蛋白表达变化相一致(P0.05),而Beclin-1和LAMP2的蛋白表达水平相比对照组降低(P0.05)。2.尼古丁通过α7nAChR(尼古丁血管内皮细胞膜受体)激活AMPKα、ERK1/2/p38 MAPK信号,但信号的活化并不影响尼古丁对自噬流的抑制作用。与对照组相比,AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK在尼古丁处理的各时间点都有磷酸化水平的增加,其中AMPKα在尼古丁干预30 min时磷酸化水平最高(P0.01),而ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平最高则出现在尼古丁干预15 min时(P0.01)。用α7nAChR siRNA处理后,与尼古丁处理30 min或15 min相比,AMPKα、ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平明显下降,而与对照组相比,JNK在60 min内磷酸化水平无统计学意义(P0.05)。与尼古丁组相比,AMPKα基因沉默时SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表达无明显变化(P0.05)。此外,p38 MAPK抑制剂SB203580与ERK1/2抑制剂PD98059预处理后SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表达水平也无明显变化(P0.05);而α7nAChR沉默后,SQSTM1/p62和LAMP2的蛋白表达与尼古丁组相反(P0.05)。3.尼古丁通过促进HUVECs内ROS生成,进而抑制自噬流自噬小体的清除。与对照组相比,尼古丁组HUVECs内ROS生成显著增加(P0.01);沉默α7nAChR后细胞内ROS生成明显减少(P0.01)。与尼古丁组相比,ROS清除剂(NAC)组SQSTM1/p62蛋白表达水平显著降低(P0.01),而LAMP2蛋白表达明显增加(P0.01)。结论:1.尼古丁可通过外源性凋亡途径而非内源性线粒体凋亡途径促进HUVECs凋亡,且对自噬有调节作用,其中自噬小体的生成和降解都受阻,特别是抑制自噬流自噬小体的清除。2.尼古丁通过结合细胞膜α7nAChR增加AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK的磷酸化水平,但尼古丁对自噬小体清除的抑制作用并非通过AMPKα和ERK1/2/p38MAPK依赖途径。3.尼古丁通过促进HUVECs内ROS的过量生成,进而抑制自噬流自噬小体的清除。
【图文】：

尼古丁,凋亡相关蛋白

2 结果2.1 尼古丁增加 HUVECs 凋亡相关蛋白的表达及细胞凋亡率HUVECs 分为空白对照组、尼古丁组，尼古丁干预 24 h 后采用 Western Blot检测 cleaved caspase-9、cleaved caspase-8 和 cleaved caspase-3 的蛋白表达，采用流式细胞术检测血管内皮细胞凋亡率。结果如图 1-1 所示，尼古丁处理后 cleavedcaspase-8 和 cleaved caspase-3 蛋白表达水平相比对照组显著增加（P<0.01），而cleaved caspase-9 蛋白几乎没表达（P>0.05）；图 1-2 显示，相比空白对照组，尼古丁干预后血管内皮细胞凋亡率显著增加（P<0.01），这与凋亡蛋白的检测结果（图 1-1）一致，提示尼古丁通过外源性而非内源性线粒体凋亡途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡。

尼古丁,脐静脉内皮细胞,氯喹,自噬

图 1-2 尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡率的影响（x±s, n＝6）注：与 CON 组相比 **P<0.01.2 尼古丁对自噬的调节作用HUVECs 分为正常对照组（CON），尼古丁组（NIC），氯喹组（25 mM，CQ喹+尼古丁组（CQ+NIC）。Western Blot 检测 LC3Ⅱ蛋白表达变化。结果如-3 所示，与正常对照组相比，尼古丁处理组 LC3Ⅱ蛋白表达水平显著增P<0.01）；氯喹组 LC3Ⅱ蛋白表达也显著增加，而氯喹预处理尼古丁组 LC3白表达相比氯喹单独处理组并无明显改变（P>0.05），，这提示尼古丁作用下内自噬小体大量堆积，自噬流严重受阻。与此同时，进一步检测了自噬相关蛋白 Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2白表达变化。结果如图 1-4 所示，与空白对照组相比，尼古丁处理后 Becli
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】