CREG调控巨噬细胞极化的细胞学研究

发布时间：2020-03-31 05:38

【摘要】：目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉血管脂质沉积和免疫炎症交互作用所致的慢性增生性血管重构过程。AS发病机制十分复杂,研究人员先后提出脂质浸润、内皮损伤等多种学说,但均不能全面解释AS的形成机制。1999年,Ross等提“AS是单核巨噬细胞与入侵动脉壁的病原性脂蛋白相互作用导致的慢性炎症反应过程”,这一观点得到广泛认可,为AS发生机制研究提供了新的方向。巨噬细胞是参与炎症反应最重要的免疫细胞之一,可在多种炎症介质的刺激下募集到损伤的靶血管处,进而通过分泌大量的炎症因子、吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白及细胞碎片影响AS的发生、进展及消退。目前研究证实,巨噬细胞在不同微环境下,可以极化成为促炎的M1亚型和抑炎的M2亚型。巨噬细胞向M1极化增多、向M2极化减少被认为是AS发生发展的病理基础之一。但是,调控巨噬细胞极化的关键分子仍未阐明。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,CREG)是一种小分子(220个氨基酸)糖蛋白,在细胞内主要定位于核周内质网和溶酶体。CREG在分化成熟的组织中广泛表达,能促进心肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等多种细胞的分化,被认为是一种重要的细胞分化稳态调节因子。此外,本实验室的前期研究发现,CREG能对抗AS的发生发展并抑制巨噬细胞的炎症反应,但其机制尚不清楚。基于以上线索,本研究提出假说,即CREG可能是调控巨噬细胞极化的关键因子。为检验该假说,本研究拟采用单核巨噬细胞系,在体外建立巨噬细胞极化模型,明确CREG在巨噬细胞极化中的作用,并初步探讨其机制。本研究的实施将为巨噬细胞新的极化调控机制提供实验依据和理论线索,并可能为AS的防治提供新的干预靶点。方法(1)在体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,100ng/ml)+伽马干扰素(interferon-γ,IFN-γ,20ng/ml)诱导其向经典活化型(M1)极化,用白细胞介素4(interleukine-4,IL-4,20ng/ml)诱导其向替代活化型(M2)极化,建立巨噬细胞极化模型。以未诱导细胞作为对照组。通过流式细胞术、ELISA、蛋白印迹法(Western blot)及定量PCR方法,检测M1型及M2型巨噬细胞比例及标志物表达,验证巨噬细胞极化模型是否建立成功。进一步通过Western blot、定量PCR及免疫荧光染色检测M1型及M2型巨噬细胞标记物、CREG及溶酶体标志物表达[包括溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP-1)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP-2)及溶酶体整合膜蛋白2(lysosome integral membrane protein 2,LIMP-2)],明确CREG表达水平与巨噬细胞极化及溶酶体标志物的相关关系。(2)应用腺病毒感染和siRNA基因沉默方法分别建立CREG低表达和过表达巨噬细胞模型,应用流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞比例,Western blot方法检测M1型、M2型巨噬细胞标记物表达及溶酶体标志物表达,明确CREG与巨噬细胞极化的因果关系。(3)在过表达CREG蛋白的RAW264.7细胞中,应用siRNA技术建立LAMP-1低表达的巨噬细胞模型,应用流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞比例,Western blot方法检测M1和M2型巨噬细胞标志物、CREG蛋白及溶酶体标志物表达,明确CREG是否通过影响溶酶体途径调控巨噬细胞极化。结果(1)流式细胞术检测结果显示,与未诱导对照组相比,LPS+IFN-γ诱导巨噬细胞向M1型极化后,PE-F4/80、FITC-CD16/32双阳性标记的M1型巨噬细胞比例达(83.18±3.07)%;IL-4诱导巨噬细胞向M2极化后,PE-F4/80、FITC-CD206双阳性标记的M2型巨噬细胞比例达(42.79±2.70)%。Western blot和ELISA结果发现,M1型巨噬细胞中高表达iNOS蛋白并大量分泌促炎症因子MCP-1、TNF-α;而M2型巨噬细胞中高表达CD206蛋白并大量分泌抑炎因子IL-10、TGF-β1。以上结果表明,我们成功建立了巨噬细胞极化模型。此外,定量PCR及Western blot结果显示,与对照组相比,CREG和溶酶体标志物(LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2)的转录及蛋白水平表达在M1型极化组中降低,而在M2型极化组中增加,提示CREG及溶酶体水平与巨噬细胞极化存在正相关关系。(2)Western blot结果发现,腺病毒感染巨噬细胞后CREG表达明显增加,而siRNA转染巨噬细胞后CREG表达显著降低,表明我们成功建立了过表达及低表达CREG的巨噬细胞模型。在过表达CREG巨噬细胞组:与感染表达GFP腺病毒的对照组相比,(1)流式细胞术结果显示,经LPS+IFN-γ诱导后,PE-F4/80、PerCP-CD16/32双阳性M1型巨噬细胞比例显著降低[(56.91±3.31)%vs.(73.94±2.37)%,P0.05];经IL-4诱导后,PE-F4/80、PerCP-CD206双阳性M2型巨噬细胞比例显著增加[(43.93±2.11)%vs.(28.65±1.97)%,P0.05]。(2)Western blot结果发现,经LPS+IFN-γ诱导后,M1型巨噬细胞标志物iNOS蛋白表达显著降低;经IL-4诱导后,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达显著增加。这些结果表明,过表达CREG可抑制巨噬细胞向M1型极化、促进巨噬细胞向M2型极化。在低表达CREG巨噬细胞组:与对照siRNA组相比,(1)流式细胞术结果显示,经LPS+IFN-γ诱导后,PE-F4/80、PerCP-CD16/32双阳性M1型巨噬细胞比例显著增加[(73.94±2.37)%vs(90.30±2.31)%,P0.05];经IL-4诱导后,PE-F4/80、PerCP-CD206双阳性M2型巨噬细胞比例降低[(25.23±0.17)%vs(17.06±1.81)%,P0.05]。(2)Western blot结果发现,经LPS+IFN-γ诱导后,M1型巨噬细胞标志物iNOS蛋白表达增加,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达显著降低;。这些结果表明,低表达CREG可促进巨噬细胞向M1型极化。此外,我们还发现,在过表达CREG巨噬细胞组:经LPS+IFN-γ和IL-4诱导后,溶酶体标记物LAMP-1和LAMP-2蛋白明显增加;而在低表达CREG巨噬细胞组,溶酶体标记物LAMP-1和LAMP-2蛋白明显减少。这一结果提示,溶酶体可能参与CREG对巨噬细胞极化的调控。(3)为了探讨CREG是否通过调控溶酶体发挥作用,我们在过表达CREG的巨噬细胞中,应用siRNA LAMP-1将LAMP-1敲减,观察CREG的作用是否被阻断。(1)Western blot结果发现:腺病毒-CREG组中CREG蛋白明显增加,siRNA LAMP-1组LAMP-1蛋白表达明显降低,表明过表达CREG的巨噬细胞中LAMP-1被敲减成功。与对照siRNA组相比较,在LAMP-1 siRNA组中M1型巨噬细胞标记物iNOS表达增加(P0.05),而M2型巨噬细胞标记物CD206表达降低(P0.05)。(2)流式细胞术结果示,与对照siRNA组相比较,在LAMP-1siRNA组,PerCP-CD16/32阳性M1型巨噬细胞比例明显增加[(15.40±1.86)%vs(37.33±2.91)%,P0.05],PerCP-CD206阳性巨噬细胞比例明显降低[(12.67±1.20)%vs(5.33±0.44)%,P0.05]。这些结果表明,将巨噬细胞中LAMP-1敲减后,能够阻断CREG的作用,LAMP-1可能是CREG下游靶点。结论CREG是调控巨噬细胞向M2型极化的重要分子,其机制可能是通过影响溶酶体发生。本研究为巨噬细胞极化的分子机制提供了新的实验依据,同时有望为AS的预防和治疗提供新的靶点。
【图文】：

图 1 M1、M2 型巨噬细胞比例（流式细胞术）注：RAW264.7 细胞经 LPS（100ng/mL）+IFN-γ（20ng/ mL）刺激 24h 向 M1 型巨噬细胞诱导；IL-4（20ng/ mL）刺激 24h 向 M2 型巨噬细胞诱导；Control 为空白对照。与对照组相比，*P<0.05，n=3。（二）ELISA 检测细胞培养上清中炎症因子表达M1 型巨噬细胞分泌主要分泌促炎因子，如 TNF-α 和 MCP-1。M2 型巨噬细胞主要分泌抑炎因子，如 IL-10 和 TGF-β1。ELISA 结果显示，经 LPS（100ng/mL）+IFN-γ（20ng/mL）刺激诱导 M1 型巨噬细胞培养上清中，TNF-α[（1048±83.47）pg/mL vs （2356±85.31）pg/mL，P<0.05]和 MCP-1[（821.6±7.47）pg/mL vs（1976±15.31）pg/mL，P<0.05]含量高于对照组，而经 IL-4（20ng/mL）刺激诱导 M2 型巨噬细胞培养上清中，IL-10[（151.6±8.35）pg/mL vs（561.7±39.41）

图 2 ELISA 方法检测细胞培养上清中炎症因子表达与 Control 组相比较，*P<0.05，n=3。三）Western blot 检测 M1、M2 型巨噬细胞表面标志物物表达证本实验 M1 及 M2 型巨噬细胞是否诱导成功，，我们用 WesterM1 型标志物（iNOS、TNF-α）和 M2 型标志物（CD206）表达与对照组相比较，经 LPS+IFN-γ 向 M1 型诱导的巨噬细胞中 表达增加（PiNOS=0.001；PTNF-α=0.018）；经 IL-4 向 M2 型诱导06 表达增加（PCD206=0.003）。，为探讨CREG及溶酶体与巨噬细胞极化的相关性，我们用We组细胞 CREG 与溶酶体标志物（LAMP-1、LAMP-2 及 LIMP-2
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

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本文编号：2608649