藻蓝蛋白对巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积的影响机制研究

发布时间：2020-04-02 08:33

【摘要】：[背景与目的]动脉粥样硬化(As)是由脂质代谢紊乱等多种因素引起的一种血管退行性病变,严重危害人类健康。在As众多的发病机理中,巨噬细胞源性泡沫细胞的形成构成其核心环节。因此,减少巨噬细胞源性泡沫细胞形成对As的防治具有重要意义。以往研究表明,脂蛋白脂酶(LPL)是水解血浆甘油三酯的关键限速酶,对降低血浆甘油三酯水平至关重要。然而,LPL在巨噬细胞中却通过介导细胞内脂质蓄积促进泡沫细胞形成,从而发挥促As的作用。探索调控LPL表达的作用机制,减少巨噬细胞脂质蓄积,对于防治As具有重要意义。藻蓝蛋白(PC)是一种存在于藻类中的色素蛋白,在螺旋藻中的含量约为10%~20%,常温下结构稳定。研究表明,PC在抗氧化、抗肿瘤、免疫应答等方面发挥着多种生物学功能,但其是否通过减少巨噬细胞脂质蓄积从而影响泡沫细胞形成的机制尚未阐明。丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(TAK1),能够调节细胞的增殖与凋亡,介导多种促炎症和促存活信号通路的激活,参与As的病理进程。应激活化蛋白激酶(JNK)是位于TAK1下游的因子,TAK1表达升高可增加磷酸化JNK水平,从而引起JNK下游因子的激活或抑制。转录激活因子3(ATF3),是ATF/环磷腺苷效应元件结合蛋白转录因子家族的成员,位于JNK下游,它是富含甘油三酯的脂蛋白脂解产物的关键反应基因,能够诱导促炎因子聚集,促进As的发生。然而,TAK1/JNK/ATF3信号途径是否参与PC调控巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积的机制尚不清楚。miR-10a-5p是新近发现的一个RNA分子,与肿瘤的发生、炎症反应密切相关。研究发现,miR-10a-5p能够靶向结合TAK1,从而增加As斑块的面积,加速As的发生。但miR-10a-5p是否参与PC调控巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积的机制尚不明确。因此,本研究的目的是从脂质代谢的角度,探究PC对巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积的影响机制。[方法]THP-1细胞置于10%胎牛血清(PBS)的RPMI 1640培养基(含10U/mL青霉素和10U/mL链霉素)中培养,将细胞培养箱温度保持在37℃,同时保证箱内5%的CO_2浓度。用160nmol/L的佛波醇(PMA)孵育THP-1细胞48小时,促进其分化,转变为巨噬细胞,50μg/ml的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)无血清培养基处理细胞。首先,PC(5、10、20μg/ml)或PBS孵育巨噬细胞6、12、24小时,然后用RT-PCR和Western Blot检测LPL mRNA及表达,LPL活性比色法定量检测试剂盒检测LPL活性,高效液相色谱(HPLC)用于检测细胞内脂质含量变化情况;染色质免疫共沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因(Luciferase)分别检测PC对转录因子ATF3与LPL启动子区结合以及LPL启动子活性的影响,RT-PCR和Western Blot分别检测PC对ATF3 mRNA及表达,LPL mRNA及表达的影响;接着,使用TAK1过表达质粒,JNK激活剂茴香霉素和ATF3过表达质粒处理后,RT-PCR和Western Blot分别检测PC对TAK1 mRNA及表达、JNK及其磷酸化水平、ATF3 mRNA及表达,LPL mRNA及表达的影响,验证PC是否通过TAK1/JNK/ATF3信号通路影响LPL的表达。最后,利用生物信息学分析手段预测并比对不同物种间miR-10a-5p的序列、保守性及其靶标基因,以此为基础确定miR-10a-5p与TAK1存在结合位点,借助MicroRNA靶标预测网站对两者的结合自由能进行评分。荧光素酶报告基因检测miR-10a-5p与TAK1 3’UTR靶向结合情况,miR-10a-5p抑制剂转染巨噬细胞24小时,同时加入PC进行处理,RT-PCR和Western Blot检测相关基因及蛋白的表达情况。[结果]RT-PCR,Western Blot和HPLC检测发现,PC处理的巨噬细胞中LPL mRNA及表达、总胆固醇、游离胆固醇,胆固醇酯的水平呈浓度和时间依赖性显著降低;通过生物信息学预测分析发现转录因子ATF3与LPL的启动子之间可能存在结合位点;荧光素酶报告基因和ChIP的结果表明,转录激活因子ATF3能够增强LPL启动子的活性,PC明显抑制ATF3与LPL启动子的结合;RT-PCR和Western Blot检测发现,PC减少ATF3 mRNA及表达并下调LPL mRNA及表达,但当过表达ATF3后,能够逆转PC对LPL的抑制作用,表明ATF3是参与调控LPL的关键因子。接下来检测PC对JNK的影响,结果发现PC能够抑制JNK的激活,并且在使用JNK激活剂茴香霉素处理后,恢复了ATF3与LPL mRNA及表达;JNK是MAPK信号通路的另一亚类,其中TAK1是JNK的上游,进一步检测PC对TAK1的影响,结果显示PC抑制TAK1 mRNA及表达,并且在过表达TAK1后,JNK重新激活,ATF3与LPL mRNA及表达明显恢复正常,证明PC通过TAK1/JNK/ATF3信号途径抑制LPL的表达;生物信息学分析提供的数据表明,miR-10a-5p在不同物种间高度保守,miR-10a-5p与TAK1结合具有种子序列且两者的结合自由能较低,这些结果提示miR-10a-5p具有靶向结合TAK1 3’非翻译区(3’UTR)的可能,通过TargetScan网站分析发现,LPL 3’非翻译区(3’UTR)与miR-10a-5p没有结合位点。PC处理能够明显增加巨噬细胞内miR-10a-5p的水平;荧光素酶报告基因检测结果证实miR-10a-5p靶向结合TAK1 3’非翻译区(3’UTR)。当加入PC处理时,能够明显减少pJNK水平,以及TAK1、ATF3,LPL mRNA及表达;但经miR-10a-5p inhibitor处理后,恢复了pJNK水平,以及TAK1、ATF3,LPL mRNA及表达的促进作用,表明miR-10a-5p参与了PC调控LPL表达及巨噬细胞脂质蓄积的过程。[结论]PC通过上调miR-10a-5p,抑制TAK1/JNK/ATF3信号通路,减少THP-1巨噬细胞LPL表达及脂质蓄积。
【图文】：

PC下调LPL的表达并减少巨噬细胞脂质蓄积假说图

不同浓度PC对巨噬细胞LPL表达及活性的影响
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5

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本文编号：2611712