miR-186-5p作为急性冠脉综合征标志物的临床价值及其作用机制研究

发布时间：2020-04-02 10:37

【摘要】：研究背景:急性冠状动脉综合征(ACS)是一种常见的缺血性心脏病急症,具有高病死率及致残率。经皮冠状动脉介入(PCI)可及时恢复ACS患者冠状动脉血流灌注,改善心肌缺血,是目前治疗ACS最常用方式之一,但ACS患者PCI治疗后发生主要不良心血管事件(MACE)的风险仍然较高。然而,目前尚缺乏用于PCI治疗效果监测及术后MACE预测的非侵入性血清学指标。miRNA是长度为19-23个核苷酸的非编码小RNA,主要在转录后水平下调靶基因表达。最新研究发现,循环miRNA可作为ACS患者诊疗过程中良好指标。前期研究表明,ACS患者血清miR-186-5p水平显著升高,且血清miR-186-5p可作为心血管疾病危险分层的分子标志物,提示其作为ACS诊断及预后监测循环标志物的潜能。然而,血清miR-186-5p在ACS患者PCI治疗前后水平动态变化、分布形式、预后价值及miR-186-5p参与心肌缺血缺氧的机制尚待进一步探究。目的:(1)检测ACS患者PCI治疗前后血清miR-186-5p水平动态变化,分析miR-186-5p在血清中分布形式以及在ACS患者PCI治疗中的临床价值;(2)探寻miR-186-5p在心肌细胞缺血缺氧过程中的作用机制。方法:(1)选取92例ACS患者及96例健康者作为研究对象,收集ACS患者入院即刻、PCI术后7天内以及健康对照禁食12小时以上的血清样本,采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测血清样本中miR-186-5p水平;采用Life公司外泌体(exosome)提取试剂盒分离exosome及去外泌体上清(exosome-depleted),分别检测并比较二者中miR-186-5p水平差异;随访ACS患者PCI术后1年内MACE发生情况;通过ROC曲线、Logistic回归、Spearman相关性及Cox回归分析等多种统计学方法分析血清miR-186-5p与ACS患者PCI治疗监测及预后价值。(2)通过生物信息学软件预测miR-186-5p靶基因;采取左侧冠状动脉结扎术构建SD大鼠心肌梗死(AMI)模型,检测大鼠血清miR-186-5p水平及心肌组织miR-186-5p及相关蛋白水平变化;采用Anaeropack厌氧袋结合无糖无血清培养基构建心肌细胞(H9C2)糖氧剥夺(OGD)模型,检测并分析细胞中miR-186-5p及靶相关蛋白水平变化,采用荧光素酶报告实验验证miR-186-5p与预测基因的靶向关系,运用蛋白免疫印迹、流式细胞术及细胞增殖实验探索与验证miR-186-5p在心肌细胞急性缺糖缺氧中的潜在的作用机制。结果:(1)ACS患者(STEMI组,NSTEMI组,UA组)血清miR-186-5p水平较对照组显著升高(p均0.05),患者组之间水平无明显差异;ACS患者PCI术后血清miR-186-5p水平较术前显著降低(p均0.05),术后2天恢复至对照组水平(p0.05);对照组、ACS患者PCI治疗前后血清样本exosome中miR-186-5p水平均显著低于exosome-depleted中水平(p均0.05),ACS患者PCI治疗前后exosome-depleted样本中miR-186-5p水平变化与总血清miR-186-5p水平变化一致,且二者中miR-186-5p水平均呈正相关(r=0.238,p0.05),ACS患者、对照组血清exosome中miR-186-5p水平无明显差异(p均0.05);相关性分析提示ACS患者血清miR-186-5p水平与HDL-C水平及LVEF呈负相关(p均0.05),与LDL-C水平、Genisi评分及GRACE评分呈正相关(p均0.05);ROC曲线分析血清及exosome-depleted中miR-186-5p诊断ACS的曲线下面积分别为为0.70(95%CI:0.62~0.78)和0.81(95%CI:0.70~0.91),多因素Logistic分析表明血清及exosome-depleted中miR-186-5p可作为预测ACS发生独立危险因素(OR=1.08,95%CI:1.03~1.14;OR=1.12,95%CI:1.03~1.23);随访结果表明ACS患者PCI术后1年MACE发生率为33.7%,发生MACE的患者术前血清miR-186-5p水平显著高于未发生MACE组患者(p0.05);多因素Cox回归分析提示血清miR-186-5p可作为ACS患者PCI术后1年发生MACE良好预测因子(HR=1.44,95%CI:1.02~2.06)。(2)生物信息学软件分析提示细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)可能为miR-186-5p靶蛋白;动物实验中,与假手术组比较,AMI大鼠血清miR-186-5p水平升高(p均0.05),缺血心肌组织中miR-186-5p水平降低(p均0.05),而ERK1/2、cleaved caspase-3水平升高(p均0.05);细胞实验中,与对照组比较,OGD组H9C2细胞中miR-186-5p水平升高(p均0.05),细胞外培养基中miR-186-5p水平降低(p均0.05),OGD组细胞ERK1/2、cleaved caspase-3水平升高(p均0.05),过表达或抑制miR-186-5p表达后,ERK1/2与之呈负向水平变化;荧光素酶报告实验证明miR-186-5p可与ERK1/2 mRNA的3’-UTR靶向结合;凋亡实验显示,OGD处理8小时后H9C2细胞凋亡率显著增加,OGD处理组及无处理组过表达miR-186-5p后细胞凋亡率均显著降低(p均0.05);细胞增殖实验结果表明,OGD处理8h后H9C2细胞增殖能力下降,OGD处理组及无处理组过表达miR-186-5p后细胞增殖能力均增加(p均0.05)。结论:ACS患者血清miR-186-5p水平升高,PCI治疗后水平下降,血清中miR-186-5p主要以非外泌体形式存在,可能来源于心肌细胞被动释放,且血清miR-186-5p水平与ACS患者术后1年内MACE发生具有良好相关性,心肌细胞中miR-186-5p可通过靶向ERK1/2调控缺糖缺氧所诱导的细胞凋亡及增殖过程。本研究为miR-186-5p应用于ACS患者PCI治疗效果监测、预后评估及治疗等提供了新思路。
【图文】：

miR-186-5p 作为急性冠脉综合征标志物的临床价值及其作用机制研究将 pri-miRNA 在分子基部切割双链形成大小约 70 nt 并能形成茎称 pre-miRNA，，pre-miRNA5 末端具有磷酸基及多聚腺苷酸酸突出体；然后通过 Ran-GTP 依赖性转运蛋白 Exportin-5 端的二核苷酸突出将其由胞核运输至胞质；随后，胞质中另一种 pre-miRNA 剪切形成不完全配对的 RNA 双链体（miRNA为成熟 miRNA 与其互补序列所组成的二聚体。miRNA：miR选择性整合到 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing一条未被整合的单链 miRNA*可迅速降解，而通常来源于较低NA 更易被整合入 RISC。具体过程如图 1.1 所示。

miR-186-5p 作为急性冠脉综合征标志物的临床价值及其作用机制研究iRNA 及其他多种活性物质的 MV 可随体液循环达到靶细胞，随后通过内吞结合等方式进入靶细胞，调控靶细胞的生物学活动。（3）与 RNA 结合蛋白合物后被分泌，已知的循环 miRNA 结合蛋白有高密度脂蛋白（HDL）、ArgonO2）、核磷蛋白 nucleophosmin 1 (NPM1)等，后两种分泌方式为主动的、耗链 RNA 在细胞外环境中易于被广泛存在的 RNA 酶降解，但 miRNA 可稳定循环并被检测，可能存在的保护机制主要有[39,40]：（1）miRNA 被包裹于 MV
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.4

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本文编号：2611839