瑞舒伐他汀后处理对缺血再灌注损伤保护作用的研究

发布时间：2020-04-02 12:06

【摘要】：背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中最危重的类型,发病后及时给予再灌注治疗是治疗AMI的最佳治疗方法。然而,心肌血流短暂停止后再次恢复血供,会引起较单纯缺血更严重的心肌损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠状动脉旁路搭桥术(coronary artery bypass graft,CABG)和药物基础治疗,是目前心梗再灌注治疗主要手段。伴随着再灌注治疗手段的进步,与之相伴的缺血再灌注损伤也引起临床医师愈发重视。他汀类药物具有独立于降脂作用外的心血管保护作用,其多效性包括抗炎、稳定斑块、改善内皮功能和抑制血管平滑肌增生等,研究发现他汀类药物后处理能够有效保护缺血再灌注损伤。再灌注损伤补救激酶途径(RISK)是后处理减轻IR损伤中重要信号通路。磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是其中重要信号分子。在再灌注初期,大量氧自由基(ROS)生成,造成线粒体损伤。线粒体通透性转换孔(mPTP)是线粒体膜上重要的电压依赖性离子通道,正常状态下维持线粒体膜低通透性。当缺血再灌注时,细胞内环境变化诱发线粒体膜通透性转运孔开放,导致线粒体膜电位消失,呼吸链中断,ATP耗竭,诱发细胞凋亡。而研究发现,PI3K-Akt通路、GSK-3β、细胞内钙、ROS等均参与mPTP开放的调节,在缺血再灌注损伤保护中发挥重要作用。目的本研究探讨瑞舒伐他汀(rosuvastatin,RS)对于缺血再灌注损伤的保护作用,寻找其最佳药物浓度。并探讨PI3K-Akt-GSK-3β,ROS和mPTP在其中具体作用。方法本实验采用Langendorff离体心脏灌流,采用结扎前降支后松开结扎线持续灌注的方法模拟心肌缺血再灌注。实验分为2组路线。路线1:研究不同浓度下(1-50 nmol/L)瑞舒伐他汀对缺血再灌注损伤的保护作用,寻找合适剂量范围。健康雄性Wistar大鼠随机分为8组(每组8只,n=8):(1)I/R组(2)RS组(1nmol/L)(3)RS组(5nmol/L)(4)RS组(10nmol/L)(5)RS组(25nmol/L)(6)RS组(50nmol/L)(7)5nmol/L RS+LY294002(8)LY294002组,各组均稳定灌注15min,缺血30min,再灌注60min。在再灌注时予瑞舒伐他汀(1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L)、瑞舒伐他汀联合磷脂酰肌醇(PI3K)抑制剂LY294002,或单独LY294002。灌流结束后,用伊文思蓝和氯化三苯四唑啉(TTC)双染色法测定心肌梗死面积。收集灌流液并检测肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)浓度。测定各组稳定灌流15min时、结扎前降支30min时、再灌注5、30、60min时的左室发展压(LVDP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左心室内压力最大上升速率(dp/dt_(max))值的变化。通过上述指标寻找瑞舒伐他汀心肌保护最佳浓度范围。路线2:健康雄性Wistar大鼠随机分为5组(每组8只,n=8):(1)I/R组(2)RS组(5nmol/L)(3)5nmol/L RS+LY294002(4)LY294002组(5)假手术组。采取稳定15min,缺血30min,再灌注10min模式。再灌注时予5nmol/L瑞舒伐他汀,瑞舒伐他汀+LY294002,或单独LY294002。在再灌注10min后剪下左室前壁心肌组织,采用DCFH-DA方法检测活性氧自由基(ROS)水平。检测心肌组织内超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)水平。应用Western blot检测各组左室前壁心肌PI3K-Akt-GSK-3β通路水平。分离线粒体并检测钙诱导线粒体通透性转换孔(mPTP)开放水平。探讨PI3K-Akt-GSK-3β通路,ROS,及mPTP在瑞舒伐探讨后处理心肌保护作用中的具体机制。实验数据进行单样本KS检验,以均数±标准差表明,组间比较用单因素方差分析,多组间的多重比较采用SNK-q检验。p0.05为差异有统计学意义。结果(1)瑞舒伐他汀减轻再灌注损伤作用呈现浓度依赖性,1 nM组心肌梗死范围与对照组无明显差别,而5-10 nM组心肌梗死范围较对照组明显减少,最佳浓度为5 nM(25.69±3.75%vs 40.04±4.93%,p0.05)。随着RS浓度增高,其对缺血再灌注损伤保护作用减退,在50nM组甚至出现加重趋势(47.75±5.27%vs40.04±4.93%,p0.05)。5nM组心肌梗死范围、LDH、CK-MB较对照组分别下降35.4%、32.9%和31.2%。5nM RS组较对照组能够降低LVEDP,升高LVDP和dP/dtmax。RS+LY294002组、LY294002组心肌梗死范围、LDH、CK-MB与对照组无差异(p0.05)。各组血流动力学指标在稳定期和结扎期无明显区别。RS+LY294002组、LY294002组LVDP、LVEDP、dP/dtmax与对照组无显著差别(p0.05)。(2)RS组左室心肌p-Akt和p-GSK-3β的表达明显高于I/R组(p0.05)。RS+LY294002组、LY294002组p-Akt和p-GSK-3β的表达与对照组相似(p0.05),LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对p-Akt和p-GSK-3β的激活,但其本身对p-Akt和p-GSK-3β激活无影响。在各组中总Akt和GSK-3β表达无差别(p0.05),在假手术组p-Akt和p-GSK-3β磷酸化未被激活。(3)I/R组MDA和ROS生成较对假手术组明显增加,同时SOD活性下降,表明缺血再灌注时ROS活性明显增加(p0.05)。RS后处理能够显著降低MDA和ROS生成,增加SOD活性(p0.05)。LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对ROS的抑制作用,同时其本身对ROS活性无影响。(4)在假手术组,平均诱导mPTP开放的钙离子浓度为123±26μmol Ca~(2+)/mg。在I/R组中,诱导mPTP开放的钙离子浓度降至32±10μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs sham组),表明在缺血再灌注激活mPTP开放。瑞舒伐他汀后处理增加诱导mPTP开放的钙离子浓度至90±18μmol Ca~(2+)/mg(p0.05 vs I/R组),表明瑞舒伐他汀后处理抑制mPTP开放。但瑞舒伐他汀本身对于mPTP开放无明显影响(117±24vs 123±26μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。同时,LY294002能够消除瑞舒伐他汀后处理对mPTP开放的抑制作用(41±9 vs 90±18μmol Ca~(2+)/mg,p0.05)。表明瑞舒伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt通路,抑制mPTP开放产生心肌保护作用。结论(1)瑞舒伐他汀降低再灌注损伤呈现浓度依赖性。在5 nM时,瑞舒伐他汀后处理可以有效减少再灌注时心肌梗死面积,改善再灌注时血流动力学,有心肌保护作用。随着RS浓度增高,其对缺血再灌注损伤保护作用减退,在50nM组甚至出现心肌损害趋势。(2)瑞舒伐他汀后处理通过激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,产生心肌保护作用。(3)瑞舒伐他汀后处理抑制ROS生成,产生心肌保护作用,且对ROS的抑制作用是PI3K-Akt-GSK-3β通路依赖性的。(4)瑞舒伐他汀后处理抑制mPTP开放。mPTP作为PI3K-Akt-GSK-3β通路和ROS系统的终末效应器,在瑞舒伐他汀后处理心肌保护作用中发挥关键作用。
【图文】：

心肌保护,信号通路,后处理

图1：后处理心肌保护中的信号通路。引用自文献[38]。细胞外的腺苷，缓激肽，阿片类药物等信号分子结合至细胞膜上相应受体后激活细胞内信号通路:PI3K-Akt通路，p42/p44 ERKs通路，SAFE通路，随后进一步活化信号瀑布中下游信号分子：NO, GSK-3 ,PKC,线粒体KATP通路，最终作用于线粒体mPTP，抑制其开放，发挥心肌保护作用。他汀类药物是目前临床上广泛应用的调脂药，在冠状动脉性心脏病(coronaryartery disease，CAD )的一级和二级预防[39]中发挥着非常重要的作用。在实验研究已经表明他汀类药物具有独立于降脂作用外的心血管保护作用，，其多效性包括抗炎、稳定斑块、改善内皮功能和抑制血管平滑肌增生等[40]。临床研究(ARMYDA-ACS实验)[41]发现非ST段抬高的ACS患者在进行PCI前使用阿托伐伐他汀能够显著减少30天内心脏不良事件的发生（阿托伐伐他汀组发生心肌梗死5%，对照组15%）。而研究表明，瑞舒伐他汀的降脂作用较传统的阿托伐他汀等药物更加强大，血脂达标率更高，因而其心肌保护作用亦引发研究热情。Yun等[42]在ACS患者行PCI术后给予40mg瑞舒伐他汀，研究发现瑞舒伐他汀组

缺血再灌注损伤,后处理,对照组,保护作用

各组染色结果见图 1-4，非缺血区被伊文思蓝染成蓝色，缺血区未被蓝染。各组缺血区面积类似，表明各组结扎前降支供血范围基本相同。缺血区包含括梗死区和非梗死区：非梗死区为砖红色，梗死区为灰白色。RS 组 MI 范围为40.04±4.93%。RS 后处理对心肌梗死面积影响呈现浓度依赖性。1 nM 组心肌梗死范围与对照组无明显差别，而 RS 组(5-10 nM )较对照组明显减少，最佳浓度于 5 nM（25.69±3.75% vs 40.04±4.93%, p < 0.05 表 1-2）。随着 RS 浓度增高，其对缺血再灌注损伤保护作用减退，在 50nM 组甚至出现加重趋势(47.75±5.27%vs 40.04±4.93%, p < 0.05)。RS+ LY294002 组心肌梗死范围与对照组相似（38.76%±4.13 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 组心肌梗死范围与对照组无明显差别（41.67%±4.82 vs 40.04±4.93%, p>0.05）。LY294002 能够消除瑞舒伐他汀后处理的对于减少心肌梗塞面积的保护作用（p<0.05），且其本身并未影响缺血再灌注损伤时心肌梗塞面积，表明瑞舒伐他汀后处理激活 PI3K-Akt 通路发挥心肌保护作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22

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