银杏叶提取物主要成分对人凝血酶作用机制研究

发布时间：2020-04-07 07:03

【摘要】：目的银杏叶提取物已经被广泛应用于东西方国家心血管疾病和血栓性疾病的预防和治疗,但其生物活性成分及潜在的抗血栓机制尚未被完全阐明。凝血酶,作为调节正常凝血级联以及血栓进程中的关键丝氨酸水解酶,凝血酶抑制剂疗法已被公认为心血管和血栓性疾病预防和治疗的一个有效的治疗靶点。本研究旨在考查银杏叶提取物中主要成分对人凝血酶活性的抑制能力并揭示了银杏叶提取物对心血管疾病预防和治疗的潜在机制。方法1.通过凝血酶及其荧光底物探针共同孵育的方法,利用多功能酶标仪测定凝血酶荧光底物探针代谢产物荧光强度,建立体外凝血酶活性抑制测定体系。2.初步评估银杏叶提取物中十六种主要成分对凝血酶活性抑制的能力。利用GraphPad Prism 6.0非线性拟合计算每种化合物的半数抑制浓度IC50值。3.通过设置一系列荧光底物浓度和抑制剂浓度,并利用Lineweaver-Burk作图和Dixon作图计算抑制动力学参数(Ki)并判断抑制类型。4.为了从酶-配体视角进一步分析抑制剂和人凝血酶之间的相互作用力,通过分子模拟对接抑制剂和人凝血酶的活性中心,阴离子结合位点1和阴离子结合位点2,以解释抑制原理和机制。结果1.初筛结果显示,浓度为100μM时,银杏叶提取物中九种化合物对人凝血酶催化Z-GGRAMC水解活性的抑制率大于50%。2.进一步评估九种化合物的半数抑制浓度IC_(50)。在所有被检测的银杏叶提取物成分中,四种双黄酮类化合物包括银杏双黄酮,异银杏双黄酮,白果双黄酮,穗花杉双黄酮,表现出对凝血酶强烈的抑制作用,半数抑制浓度IC_(50)范围由8.05μM到17.83μM;五种黄酮类化合物对凝血酶表现出中等的抑制作用,其半数抑制浓度IC_(50)范围由23.90μM到82.08μM;萜类内酯对凝血酶表现出可以忽略不计的抑制作用。3.通过设置一系列荧光探针浓度以及抑制剂浓度,进一步研究四种双黄酮抑制人凝血酶催化Z-GGRAMC水解的抑制动力学参数(Ki)以及抑制类型,结果证明四种双黄酮包括银杏双黄酮,异银杏双黄酮,白果双黄酮,穗花杉双黄酮均为混合型抑制,抑制动力学参数(Ki)的值分别为6.32μM、11.01μM、4.12μM、8.06μM。4.分子对接模拟发现四种双黄酮分别能与人凝血酶的活性中心,阴离子结合位点1,阴离子结合位点2结合,同时细致的进行了四种双黄酮作为人凝血酶抑制剂的构效关系学习,结果发现四种双黄酮C-7或C-4’’’位置的羟基能与人凝血酶活性位点的氨基酸Arg-221或Lys-60通过盐桥形成强烈的相互作用,这表明C-7或C-4’’’位置的羟基对人凝血酶的抑制作用是必须的。结论银杏叶提取物中四种双黄酮成分对凝血酶活性展现出强烈的抑制作用。这些发现为解释银杏叶提取物对心血管疾病的有益作用提供了有力的新证据,也提示双黄酮可以作为先导化合物设计和开发新的双黄酮类型的凝血酶抑制剂。
【图文】：

实验结果六种化合物对人凝血酶活性的抑制能力的初步评估光产物 AMC 的标准曲线见图 1。通过设置三种不同的化合物标准M, 10 μM 和 100 μM），初步研究银杏叶提取物中 16 种主要成分对抑制作用，如图 2 所示，在抑制剂浓度为 100 μM 时，，九种化合物异银杏双黄酮、白果双黄酮、穗花杉双黄酮、芹菜素、木犀草素奈酚、异鼠李素抑制人凝血酶催化 Z-GGRAMC acetate 水解活性大于确定其半数抑制浓度（IC50）值。

图 2 银杏叶中 16 种主要化合物不同浓度下对人凝血酶的抑制作用2 银杏叶中九种人凝血酶抑制剂半数抑制浓度（IC50）值进一步计算九种化合物的半数抑制浓度（IC50），通过设置一系列抑制剂浓度，拟合剂量依赖性抑制曲线，计算出九种抑制剂的半数抑制浓度（IC50）。结果见图 3 和表 1，其中黄芩素（一种天然的凝血酶抑制剂[23]）为阳性对照组，其半数抑制浓度（IC50）为 36.11 ± 4.68 μM。在所有检测的银杏叶提取物主要成分中，四个自然的双黄酮类化合物银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、穗花杉双黄酮对凝血酶活性展现出强烈的抑制能力，其半数抑制浓度（IC50）分别是 8.05 ± 1.50 μM、13.97 ± 0.92 μM、9.39 ± 0.51 μM、17.83 ± 1.11 μM；五个黄酮类化合物芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素对凝血酶活性展现出中等的抑制能力，其半数抑制浓度（IC50）分别是 26.80 ± 1.74 μM、23.90 ±2.06 μM、67.73 ± 7.9 μM、31.56 ± 3.08 μM、82.08 ± 18.05 μM；而萜类内酯对凝血酶的活性展现出可忽略不计的抑制能力，其半数抑制浓度（IC50）均大于 100
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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本文编号：2617600