Dvl2在不同流体切应力影响的初级纤毛发生中的作用

发布时间：2020-04-07 10:50

【摘要】：目的:探索不同流体切应力对初级纤毛发生的影响;通过构建Dvl2(Dishevelled2)慢病毒干扰和过表达载体,探索Dvl2在此过程中的作用。方法:(1)构建可调控切应力的流体动力学体外细胞模型,将h UVECs分为静置培养组(Static,STA)、紊流切应力(Disturbed Flow,DF)和层流切应力(Unidirectional Shear Stress,USS)处理组;利用免疫荧光技术检测初级纤毛的表达定位,Real-time PCR技术和Western blot技术从分子水平检测初级纤毛相关基因和蛋白的表达。(2)免疫荧光共定位技术观察Dvl2与纤毛微管蛋白γ-tubulin的胞内位置关系;免疫共沉淀技术验证Dvl2与初级纤毛相关蛋白γ-tubulin、Bbs8的胞内互作关系;Real-time PCR检测不同FSS对Dvl2 m RNA相对表达量的影响。(3)构建慢病毒载体干扰Dvl2的表达量,筛选稳转细胞株,将细胞株分为Bc(Blank Control),Nc(Negative Control),sh-Dvl2(RNAi干扰组),OE-Dvl2(过表达Dvl2组)4个组;检测病毒感染效率,Real-time PCR和Western blot技术检测各组细胞的Dvl2表达量。(4)DF和USS分别作用于四组细胞;利用免疫荧光技术检测初级纤毛的表达定位,Real-time PCR技术和Western blot技术从分子水平检测初级纤毛相关基因和蛋白的表达。结果:(1)成功构建可调控的流体动力学体外细胞模型;免疫荧光技术可见,与STA组相比,DF作用时γ-tubulin表达定位显著升高(P0.01),USS作用时γ-tubulin表达定位显著降低(P0.01);Real-time PCR可见,与STA组相比,DF作用时IFT88m RNA相对表达量显著降低(P0.01)、Bbs8 m RNA相对表达量显著升高(P0.01)、γ-tubulin m RNA相对表达量显著升高(P0.05),而USS作用时,IFT88 m RNA相对表达量显著升高(P0.05)、Bbs8 mRNA相对表达量显著降低(P0.01)、γ-tubulin m RNA相对表达量显著降低(P0.05),Western blot实验结果与Real-time PCR具有相同趋势,且差异具有统计学意义。(2)免疫荧光共定位技术可见Dvl2定位于纤毛微管蛋白γ-tubulin周围;免疫共沉淀结果可见Dvl2与Bbs8、γ-tubulin存在胞内互作关系。(3)构建慢病毒Nc(HBLV-GFP-PURO)、sh(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO sh RNA)、Dvl2(HBLV-h-Dvl2-GFP-PURO)成功,病毒滴度1×108TU/m L,细胞感染率98.6%;Real-time PCR检测结果可见,与Bc组相比,Nc组Dvl2 m RNA相对表达量差异无统计学意义(P0.05),sh-Dvl2组Dvl2 m RNA相对表达量显著降低(P0.01),OE-Dvl2组Dvl2 m RNA相对表达量显著升高(P0.01),Western blot结果与Real-time PCR具有同样的趋势,且差异具有统计学意义,细胞株构建成功。(4)免疫荧光结果可见,DF作用时,与Bc组相比,Nc组γ-tubulin表达定位差异无统计学意义(P0.05),sh-Dvl2组γ-tubulin表达定位显著升高(P0.01),OE-Dvl2组γ-tubulin表达定位显著降低(P0.05),USS作用时各组细胞γ-tubulin表达定位与DF作用具有相同趋势,且差异具有统计学意义;Real-time PCR检测结果可见,DF作用时,与Bc组相比,Nc组IFT88、Bbs8、γ-tubulin m RNA相对表达量差异无统计学意义(P0.05),sh-Dvl2组IFT88 m RNA相对表达量显著降低(P0.05),Bbs8 m RNA相对表达量显著升高(P0.01),γ-tubulin m RNA相对表达量显著升高(P0.05),OE-Dvl2组IFT88m RNA相对表达量显著升高(P0.01),Bbs8 m RNA相对表达量显著降低(P0.01),γ-tubulin m RNA相对表达量显著降低(P0.05),USS作用时,m RNA相对表达量与DF作用具有相同趋势,且差异具有统计学意义;Western blot结果可见,当DF作用时,与Bc组相比,Nc组IFT88、Bbs8、γ-tubulin蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05),sh-Dvl2组IFT88蛋白表达水平显著降低(P0.01),Bbs8蛋白表达水平显著升高(P0.05),γ-tubulin蛋白表达水平显著升高(P0.01),USS作用时,蛋白表达水平与DF作用具有相同趋势,且差异具有统计学意义。结论:FSS对初级纤毛发生有影响,DF作用促进初级纤毛发生,而USS抑制初级纤毛发生;Dvl2在细胞内与纤毛基底体蛋白及微管蛋白存在互作关系;Dvl2的过表达抑制初级纤毛的发生,而沉默Dvl2后,初级纤毛发生被促进。FSS作用于内皮细胞,影响Dvl2的表达,通过Dvl2的表达影响初级纤毛的发生。
【图文】：

5% CO2培养箱内培养；养至 80%融合度时即可进行流体切应力实验。EK 293 T 细胞培养法同 hUVECs，培养基为含 10%FBS 的高糖 DMEM。调控切应力的流体动力学细胞模型建立用Flexcell公司Streamer系统建立6通道可调控切应力的流体动力学细如图 1 所示，利用流模式控制器对 FSS 大小和方向进行调控，设置 DF式，电脑配套软件实时监测 FSS 情况，每次同时放入 6 张细胞爬片，SS 作用槽，两个阻尼器排除 6 通道系统中的空气，FSS 连续模式作用

图 2 Co-IP 原理示意图所需实验试剂平衡至室温，用超纯水配制 1×交联缓冲液；oLink 瓶子，使 AminoLin 形成均一的悬液。向并放入微量离心管中，，1000×g 离心 1 min，倒交联缓冲液洗涤 AminoLink，离心并倒掉穿流、10 μL 20×交联缓冲液、10 μL Dvl2 抗体添加
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

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本文编号：2617813