心脏血管发育及畸形纠正的基础性研究

发布时间：2020-04-11 03:54

【摘要】：心血管疾病是全球因疾病引起死亡的首要原因,严重危害人类健康。心血管的发生发育涉及到复杂的分子机制,许多遗传机制尚不明确。寻找致病基因、探究致病机理并提供可能的治疗措施是基础医学研究的意义所在。本文分两个部分分别探索了Wdpcp基因对冠状动脉发育的调节机制和表观遗传药物反苯环丙胺(TCP)纠正心脏流出道畸形的治疗效应。Wdpcp基因是平面细胞极性的效应基因,在胚胎时期通过影响细胞运动和初级纤毛生长参与到多种脏器的发生发育过程,其纯合突变小鼠(Wdpcp~(m/m))呈现无眼,多趾,肠囊肿,肾囊肿,肺动脉闭锁,房室间隔缺损等一系列畸形,类似临床上的Bardet Biedl和Meckel Gruber综合征。本研究发现Wdpcp基因对于冠状动脉的发育亦不可或缺。通过SM22α示踪冠脉平滑肌细胞,我们发现Wdpcp纯合突变小鼠的冠状动脉分支减少,平滑肌细胞数量明显下降,而冠状静脉的发育基本不受影响。PECAM免疫组化染色显示Wdpcp基因缺失并不影响冠脉血管丛的形成,相比野生型小鼠血管丛的形成速度反而加快。采用Wt1~(CreERT2)-Rosa26~(mTmG)系统示踪心外膜细胞,结果显示Wdpcp纯合突变小鼠胚胎的心外膜来源细胞(EPDCs)相比野生型小鼠显著减少,qPCR分析显示Snail2,Twist1等EMT调节基因和Vinculin,Vimentin等间充质干细胞标志基因表达明显降低。3D胶原凝胶实验证明Wdpcp纯合突变小鼠的EPDCs其迁移能力相比野生型小鼠明显下降。进一步在小鼠中特异性敲除心外膜细胞的Wdpcp基因,其冠脉缺陷表型与Wdpcp纯合突变小鼠相似。以上结果证明Wdpcp通过促进心外膜细胞的上皮-间充质转化(EMT)和迁移过程在冠脉血管丛的重塑阶段发挥作用。本研究首次呈现了一个在冠脉血管丛重塑而非形成过程中发生缺陷的小鼠模型,将为冠脉血管丛重塑过程中的分子机制研究提供帮助。22q11.2微缺失综合征(22q11.2DS)是临床上最常见的染色体微缺失综合征,常见临床症状有心血管畸形、头面部畸形、胸腺/甲状旁腺发育不良等,其中心血管畸形主要表现为法氏四联征、法氏四联征合并肺动脉闭锁,另外的类型有主动脉弓离断、右室双出口和永存动脉干等。其致病基因主要是由于T盒转录基因TBX1的单倍体不足。我们的合作者Baldini教授实验室在前期实验中发现Tbx1可通过招募甲基化转移酶增强组蛋白3赖氨酸4的单甲基化(H3K4me1)从而调控基因转录。在此工作基础上,我们以Tbx1~(LacZ/+)、Tbx1~(Neo2/LacZ)突变小鼠为研究对象,检测组蛋白去甲基化酶抑制剂TCP能否纠正Tbx 1缺失造成的心血管畸形。腹腔注射TCP,收取胚胎10.5天Tbx1~(LacZ/+)突变小鼠,通过墨汁注射观察第Ⅳ咽弓动脉形态,发现其缺陷比例下降;收取胚胎18.5天Tbx1~(Neo2/LacZ)突变小鼠,观察心脏流出道形态,发现TCP可部分纠正永存动脉干畸形,但并不能纠正胸腺缺失的表型。qRT-PCR分析显示Tbx1的表达量在TCP处理组和PBS对照组无显著差别,说明TCP并非通过上调Tbx1基因本身的表达量起作用。原位杂交实验证明TCP处理后第二心域细胞(SHF)Fgf8的表达增加,与该结果一致的是,增殖相关基因Cyclin D2在SHF细胞表达增加,增殖相关蛋白PHH3磷酸化水平提高。且TCP处理后SHF极性缺失程度减轻,αPKCζ荧光信号重新趋向细胞顶端分布。本研究为表观遗传药物TCP可纠正Tbx1单倍剂量不足效应的理论提供了强有力的体内证据,为临床上22q11.2微缺失综合征提供一种新的潜在的治疗策略。
【图文】：

Wdpcp 在心外膜细胞，心肌细胞，内皮细胞，成纤维细胞和心脏免疫细胞中均有表达[75]（图1A, 1B）。利用原位杂交的方法进一步证明在胚胎 13.5 天的小鼠心脏 Wdpcp 的表达非常广泛（图 1C）。

图 2B-2D 中黑色箭头示 LCA 的 X-gal 染色变浅，图2B 和 2C 中红色箭头所示冠状动脉主干上染色中断。而冠状静脉（LCV）在突变体中相较于对照组受影响较小（图 2B-2D）。采用 Image Pro Plus 软件定量三对对照组和实验组胚胎心脏的冠脉平滑肌细胞在冠脉中的覆盖率，发现实验组冠状动脉中其平滑肌细胞覆盖率显著低于对照组，而在冠状静脉中平滑肌细胞覆盖率在两组中无差别（图 2E）。同时在突变体中注意到会有异常的短小冠状动脉起源于主动脉的一侧（图 2B-2D 的黄色箭头所示）。为了检测冠状动脉室间隔支在突变体中是否形成异常，将心脏放在 1：1 的苯偶酰苯甲酸和水杨酸甲酯中进行透明处理，可以很清楚地看到对照组小鼠的冠状动脉室间隔支，，而在突变体中却未观察到（图 2G，2H）。以上结果显示 Wdpcp 在冠状动脉形成过程中起重要作用。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.3

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本文编号：2623117