汉黄芩素改善异丙肾上腺素诱导的鼠心肌肥厚的药效及机制研究

发布时间：2020-04-11 07:22

【摘要】：研究背景心肌肥厚(cardiac hypertrophy)是心脏在各种机械应力或者神经激素刺激下的代偿性反应,表现为心脏尺寸的增大和室壁的增厚[1,2]。在其发生的早期阶段,心肌肥厚的主要原因为心肌细胞体积增大和心肌肌节数目的增多[3,4]。但随着刺激因素的持续,心肌细胞的凋亡及间质纤维化的发生从而导致心力衰竭[5]。因此心肌肥厚是多种心血管疾病共有的病理特征。β-肾上腺素受体,是G蛋白偶联受体超家族(GPCR)的成员,广泛的分布于心肌细胞,心脏纤维细胞及内皮细胞中[6]。β-肾上腺素受体的激活可以导致其下游的信号通路的改变从而导致心肌细胞内、心肌细胞膜以及心肌细胞纤维基质发生一系列的病理生理改变,包括心肌细胞肥大、心肌细胞纤维基质增生、心肌纤维化,最终导致心力衰竭[7,8]。在神经内分泌激活的状态下,儿茶酚胺结合β-肾上腺素受体,从而导致G蛋白分离为Gαs/Gβγ和Gαi/Gβγ两组亚基。Gαs亚基游离后可以激活腺苷酸环化酶从而导致第二信使c AMP的产生,从而进一步导致心率的增快及心肌收缩力的增强[9]。而Gαi亚基的可使下游PI3K/Akt和MAPK信号通路的激活从而导致心肌肥厚[10,11,12]。因此,这些潜在的靶点都为心肌肥厚的治疗提供的新的方向。汉黄芩素(wogonin)是一种黄酮类化合物,分子式为C16H12O5,可从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensi Georg)、滇黄芩(Scutellaria amoena C.H.Wright)、半枝莲(Scutellaria rivularis Wall)等植物的根部提取[13]。它具有一系列的生物学作用,如抗氧化、抗炎、神经保护及抗肿瘤[14,15,16]。近期有报导发现汉黄芩素可以改善糖尿病心肌病。而汉黄芩素是否可以逆转肾上腺素受体激活导致的心肌肥厚及其分子机制目前还未有研究。主要研究内容:1.心肌肥厚动物模型的建立及检验汉黄芩素抗心肌肥厚的药效2.离体心肌细胞肥大模型的建立和汉黄芩素抗心肌肥厚作用机制的研究3.汉黄芩素抗心肌肥厚分子靶点的探讨主要试验方法和结果:第一部分心肌肥厚动物模型的建立及检验汉黄芩素抗心肌肥厚的药效材料与方法1.标本的收集和制备:(1)选用8周龄雄性ICR小鼠,持续皮下泵入药物异丙肾上腺素(ISO,5mg/kg/day),同时给予汉黄芩素(1、10 mg/kg/day)一天一次腹腔注射,共持续2周。(2)将所有小鼠分为5组,即对照组(Control组),汉黄芩组(Wog组),异丙肾上腺素组(ISO组),低剂量汉黄芩素治疗组(Wog 1mg/kg+ISO组),高剂量汉黄芩素治疗组(Wog 10mg/kg+ISO组)。2.利用心脏超声心动图测定左心室厚度及收缩功能;处死动物后测量心脏及体重质量。3.用苏木素-伊红(HE)染色方法观察心脏组织学形态。4.实时定量PCR方法检测心脏ANP及BNP m RNA表达水平。实验结果1.汉黄芩素逆转ISO诱导的心脏重量的增加,尽管汉黄芩素未能阻止其体重减轻,同时单独的汉黄芩素对体重或心脏重量没有影响。ISO处理2周后,显著增加HW,HW/BW,IVSd,LVPWd,LV Mass,这些都被高剂量汉黄芩素治疗组逆转。但射血分数(EF)在各组间未有统计学差异。2.心脏HE染色同样也提示,同ISO相比,高剂量汉黄芩素治疗组可以显著改善心脏的大小及心肌纤维的横截面积。3.单独使用汉黄芩素不影响心脏ANP和BNP m RNA水平,但能逆转ISO处理后小鼠心肌组织中ANP、BNP的m RNA表达的升高。小结汉黄芩素可以改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚。第二部分离体心肌细胞肥大模型的建立和汉黄芩素抗心肌肥厚作用机制的研究材料与方法1.选用ISO(10μM)体外刺激大鼠心肌细胞系(H9C2)建立离体心肌细胞肥大模型。治疗组汉黄芩素(1μM,10μM)与ISO共孵育24 h。2.实时定量PCR方法检测H9C2细胞的ANP及BNP的m RNA表达水平。3.α-SMA免疫荧光观察H9C2细胞形态。4.Western blot检测p-Akt,Akt,p-CREB,CREB,p-JNK,JNK,p-p38 MAPK,p38 MAPK,p-ERK1/2,ERK1/2蛋白表达水平。5.Wog、ISO、渥曼青霉素(wartmannin)共处理H9C2 24 h,用Western blot方法,检测p-Akt,Akt,p-Fox O1,Fox O1,p-Fox O3a,Fox O3a,p-CREB和CREB的蛋白表达。实验结果1.正常对照组相比,ISO(10μM)可显著升高ANP、BNP的m RNA表达水平。高剂量汉黄芩素组(10μM)可显著改善ISO导致的ANP及BNP表达水平的升高。2.免疫荧光α-SMA检测提示ISO刺激可使H9C2细胞体积明显增大,而汉黄芩素可以使其逆转。3.使用ISO刺激后可使Akt、CREB、JNK、p38及ERK的磷酸化水平显著升高,而使用汉黄芩素治疗后只能逆转Akt和CREB的磷酸化水平。为验证PKC信号通路,我们使用了PKC信号通路的激动剂,PDBU(5μM)和汉黄芩素(10μM)共孵育24 h后,检测ANP及BNP的m RNA水平,发现汉黄芩素不能逆转PDBU导致的ANP及BNP的升高。4.在ISO的作用下CREB的磷酸化同时受c AMP/PKA和PI3K/Akt两条信号通路的调节,而汉黄芩素未能改善DB-CAMP导致的CREB的磷酸化的改变,提示汉黄芩素减少CREB的磷酸化是通过PI3K/Akt信号通路。5.汉黄芩素可以抑制ISO导致的Akt及其下游Fox O1,Fox O3a和CREB的磷酸化升高,同时合用汉黄芩素和wartmannin,未能使Akt及其下游的磷酸化水平进一步降低,证实汉黄芩素的作用靶点位于PI3K/Akt信号通路。小结汉黄芩素通过抑制PI3K/Akt通路,改善异丙肾上腺素诱导H9C2心肌肥大。第三部分汉黄芩素抗心肌肥厚分子靶点的探讨材料与方法1.分别转染持续性激活的AKT(constitutively active Akt,AKT(CA))及Pik3ca质粒至H9C2心肌细胞24 h后,汉黄芩素(10μM)与其共孵育24 h,Western blot检测Pik3ca,p-Akt,Akt,p-Fox O1,Fox O1,p-Fox O3a,Fox O3a,p-CREB和CREB的蛋白表达。2.转染Pik3ca质粒至H9C2心肌细胞24 h后,汉黄芩素(10μM)与其共孵育24 h,用免疫荧光α-SMA染色方法观察H9C2心肌细胞的形态学变化。3.H9C2心肌细胞使用ISO(10μM)及汉黄芩素(10μM)共处理24 h,在最后8h加入MG132共孵育,Western blot检测Pik3ca及ubiquitin的蛋白表达,实时定量PCR方法检测H9C2细胞中Pik3ca m RNA的表达水平。在H9C2细胞中转染HA-tagged Pik3ca,随后加入汉黄芩素及MG132处理,使用HA-beads做免疫共沉淀,应用Western blot检测HA及ubiquitin的蛋白表达水平。4.使用ISO(10μM)及汉黄芩素(10μM)共同处理H9C2心肌细胞24 h,用Westernblot及实时定量PCR检测Nedd4l的蛋白及m RNA表达水平。转染Flag-Nedd4l质粒至H9C2中,随后加入Wog处理,应用Western blot检测Flag-Nedd4l水平。转染p GL3--2000/+1LUC Nedd4l质粒至H9C2中,随后加入汉黄芩素处理,检测荧光素酶报告基因的表达。实验结果1.Akt(CA)显著激活了下游Fox O1,Fox O3a和CREB的磷酸化,而汉黄芩素不能抑制其表达。汉黄芩素可通过抑制Pik3ca的表达抑制PI3K/Akt信号通路。2.ISO可以显著升高Pik3ca的蛋白及m RNA表达水平,而汉黄芩素减少了Pik3ca的蛋白水平而不能使其的m RNA水平降低,提示Wog加快了Pik3ca的降解。3.利用MG132处理H9C2,汉黄芩素导致蛋白泛素化的增加,同时MG132逆转Wog导致的Pik3ca的降解。HA-tagged Pik3ca质粒转入H9C2,随后使用Wog和MG132处理,免疫共沉淀提示汉黄芩素是通过增加Pik3ca的泛素化加速其降解。4.异丙肾上腺素降低H9c2细胞中Nedd41的m RNA和蛋白质表达水平。汉黄芩素可在转录和转录后水平逆转异丙肾上腺素对Nedd4l表达的抑制作用。我们通过瞬时转染在H9c2细胞中高表达Flag-Nedd4l,发现汉黄芩素不影响外源Nedd4l的蛋白质表达水平。荧光素酶报告基因检测提示汉黄芩素显著增强Nedd4l启动子荧光素酶活性。小结汉黄芩素提高心肌细胞Nedd4l的表达,Nedd4l增强Pik3ca的泛素化并促进Pik3ca蛋白被降解,最终抑制PI3K/Akt通路信号转导。总结本研究揭示,汉黄芩素特异性的提高心肌细胞中Nedd41的表达,由此促进其底物Pik3ca的泛素化降解,抑制PI3K/Akt信号通路及减少肥大基因的表达,从而改善异丙上腺素导致的心肌肥厚。
【图文】：

汉黄芩素,心肌肥厚,左室,左室重量指数

脏超声检测左室间隔厚度(IVSd)、左室后壁厚度(LVPWd)，左室舒展末期内径(LVIDd)及左室收缩末期内径(LVIDs)，射血分数 (EF (%)) 及左室重量指数（LVMass）。如表2及图2所示，较正常对照组组，ISO组的IVSd、LVPWd及LVMass均明显增加（0.89±0.02 vs 0.72±0.02，P<0.05；0.88±0.03 vs 0.75±0.01，P<0.05；111.07±2.13 vs 100.22±2.07，P<0.05）。而Wog（10 mg/kg）+ISO治疗组，能有效的逆转ISO导致的IVSd、LVPWd及LVMass的增加（0.76±0.02 vs 0.89±0.02，P<0.05；0.81±0.02 vs 0.88±0.03，P<0.05；103.21±3.11 vs 99.43±1.35

汉黄芩素,心肌肥厚,标志基因

被认为是心肌肥厚的重要标志[29]。本研究中使用qPCR证实，ISO明显升高了小鼠心肌细胞的ANP及BNP的mRNA水平，而汉黄芩素可以逆转ISO导致的心肌肥厚标志基因表达的升高,差别具有统计学意义（P<0.05）（图3）。而单用汉黄芩素对ANP及BNP mRNA水平未有明显影响（P>0.05）。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

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