rAAV9介导siRNA靶向干预p65对心肌细胞肥大和纤维化相关因子的影响

发布时间：2020-04-17 10:30

【摘要】：目的:研究以9型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV9)介导RNA干扰抑制大鼠心肌H9c2细胞中p65的表达,通过检测心肌肥大及纤维化相关指标,进一步研究靶向抑制NF-κB信号通路p65对心肌细胞肥大和纤维化的影响。方法:分别将rAAV9-eGFP及rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按不同的感染复数(multiplicities of infection,MOI)转染到H9c2细胞中,在荧光倒置显微镜下观察转染后24h-168h增强型绿色荧光蛋白(eGFP)阳性的表达情况并确定最佳感染复数和时间,采用流式细胞术检测其转染效率。CCK-8法检测病毒对H9c2细胞活力影响。将AngⅡ作为刺激因素加入到细胞中,并用qRT-PCR和Western blotting法分析p65在mRNA和蛋白水平的表达情况。用流式细胞术分析对照组及各实验组细胞的凋亡情况。ELISA检测心房利钠肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、I型胶原(Col I)、III型胶原(Col III)、转化生长因子-β(TGF-β)在蛋白水平上的表达。qRT-PCR检测ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β在mRNA水平上的表达。结果:病毒转染48 h后eGFP开始有表达,并且表达强度随着时间延长而增加,第120 h达最高值,此时流式细胞术检测转染率为(66.96±1.12)%。与空白组相比,CCK-8法检测转染病毒后,H9c2细胞的活力无明显变化。静息状态下H9c2细胞的NF-κB p65有一定活性,给予AngⅡ刺激后NF-κB p65的活性明显增高,而转染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式细胞术检测发现AngⅡ刺激组的凋亡程度明显高于空白组,而rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA组的细胞凋亡明显受到抑制。ELISA检测和qRT-PCR检测发现,转染rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表达情况,AngⅡ刺激组的ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β的表达情况明显高于空白对照组。rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA+AngⅡ组与空白对照组相比,BNP、Col I、Col III、TGF-β的表达含量明显下降,但ANP的表达含量下降不明显。结论:利用rAAV9介导RNA干扰能有效转染并抑制H9c2细胞NF-κB p65的表达,对H9c2细胞活性无明显影响,并能减少血管紧张素Ⅱ作用引起的细胞凋亡,且能有效抑制ANP、BNP、Col I、Col III、TGF-β等因子在基因和蛋白水平上的表达。
【图文】：

新疆医科大学硕士学位论文结 果 重组腺相关病毒体外转染效率的测定.1 H9c2 细胞的培养倒置相差显微镜下观察，刚复苏的 H9c2 细胞呈圆形透明，悬浮于培养基中 24h 后换液，再次观察时发现细胞已贴壁，，呈短梭形，透光度好。随着培养增加，贴壁细胞数量也增加,培养至第 3 天，细胞处于指数生长期，呈长梭形。培养至第 4 天，细胞大部分生长已成融合状态，仍呈长梭形样，此时可考（见图 1）。

图 2 激光共聚焦观察不同感染复数的 eGFP 荧光转染 H9c2 细胞的转染变化Fig. 2 Laser confocal observation of transfection of eGFPfluorescently transfected Hlls with different infections(A: MOI=1×106vg/cell; B:2×106vg/ cell; C:4×106vg/ cell; D:4vg/ cell. ×200)表 1 rAAV9-eGFP 病毒转染 H9c2 细胞的转染效率(%. x S)Table 1 Transfection efficiency of rAAV9-eGFP virus transfected H9c2 cells(%. x STime/Group 1×1062×1064×1065×10624h 0 0 0 048h 0.32±1.13 3.75±1.32 11.33±1.13 10.31±1.1872h 2.42±1.55 11.46±1.93 32.46±1.70 30.44±1.9396h 4.21±1.93 17.27±1.19 49.23±1.39 41.27±1.36120h 7.74±1.76 28.70±1.06 62.72±1.92 50.73±1.42144h 5.02±1.43 26.33±1.53 56.07±2.95 49.18±1.44168h 4.82±1.27 14.96±1.11 48.89±1.56 46.90±1.75
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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本文编号：2630765