ATF6在钙化性主动脉瓣膜中的表达及意义

发布时间：2020-04-24 03:11

【摘要】：背景及目的钙化性主动脉瓣膜疾病(Calcific aortic valve disease,CAVD)是老年病人最常见的心脏瓣膜病,钙化是其主要的特征性病理改变。瓣膜间质细胞(Valvular interstitial cells,VICs)是心脏瓣膜中的主要构成细胞,现有研究结果证实,导致瓣膜钙化的细胞学基础包括VICs凋亡导致的被动钙盐沉积以及VICs向成骨细胞样细胞表型转化的主动调控过程。有研究发现ApoE~(-/-)鼠等CAVD模型中内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)信号的激活,但ERS蛋白在瓣膜钙化中的调控作用尚不明确,其对VICs凋亡、表型转分化、增生的作用研究报道较少。本课题研究就是基于以上研究背景,首先探索ERS蛋白在钙化瓣膜中的表达,分析其对VICs凋亡、表型转分化等的调控作用。方法为以上目的,本研究分为以下三部分:(一)ERS蛋白在体外细胞钙化模型中的表达研究:采用Ⅱ型胶原酶的方法分离培养来源于猪的主动脉VICs。用含10~(-7) mol/L胰岛素、50μg/ml抗坏血酸、2 mmol/L磷酸二氢钠的10%FBS DMEM钙化培养基培养VICs,诱导钙化。采用茜素红染色检测细胞模型内钙盐沉积。采用Western blot检测ERS蛋白在细胞模型中的表达。(二)活化转录因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)在钙化性主动脉瓣膜组织中的表达研究:收集我科因CAVD行主动脉瓣膜置换术患者的钙化主动脉瓣组织,心脏移植受体的正常主动脉瓣组织作为对照,采用免疫化学法检测ATF6的表达,采用TUNEL染色检测细胞凋亡,采用茜素红染色检测组织内钙盐沉积。(三)ATF6对VICs生长和表型转化的调控研究:VICs感染靶向抑制ATF6的腺病毒(Ad-shRNA-ATF6),采用实时定量PCR、Western blot检测细胞中ATF6 mRNA及蛋白表达水平。构建VICs体外细胞钙化模型,并靶向抑制细胞模型中ATF6的表达。采用茜素红染色检测细胞模型内钙盐沉积。采用CCK-8、流式细胞分析检测VICs增殖和凋亡情况。采用Western blot检测凋亡信号通路蛋白和成骨细胞表型转化标志物表达的改变。结果(一)ERS蛋白在体外细胞钙化模型中的表达研究:茜素红证实在7天细胞模型中可见大量钙盐沉积。Western blot结果表明在钙化诱导过程中,ATF6的表达自第1天起开始逐渐升高,第3天达到高峰,与0天未处理细胞相比,均具有统计学意义(P0.05);第3天后ATF6的表达开始下降,第7天的表达量与0天未处理细胞相比,无统计学意义(P0.05)。与ATF6的表达趋势一致,活化转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,Xbp1)表达也自第1天起开始逐渐升高,第3天升到高峰后开始下降,但各组细胞的表达量与0天未处理细胞相比,无统计学意义(P0.05)。真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α,eif-2α)、生长停滞及DNA损害可诱导蛋白34(Growth arrest and DNA damage-inducible gene 34,GADD34)表达自第1天升高后降低,磷酸化真核生物翻译起始因子2α(Phosphated eIF-2α,p-eif-2α)自第2天起开始升高,各组细胞的表达量与未处理细胞相比,无统计学意义(P0.05)。(二)ATF6在钙化性主动脉瓣膜疾病组织中的表达研究:免疫组织化学检测表明ATF6在CAVD瓣膜和正常瓣膜中的阳性表达分别为44.30±10.70%和9.03±7.14%,两者相比具有统计学意义(P0.05)。TUNEL染色表明CAVD瓣膜中的凋亡率为84.76±9.30%,相关分析表明ATF6的表达量与凋亡呈正相关(r=0.62,P0.05);茜素红钙化染色结果表明,瓣膜组织多为中重度钙化,但是与ATF6表达量相关性分析并无统计学意义(P0.05)。(三)ATF6对瓣膜间质细胞生长和表型转化的调控研究:实时定量PCR和Western blot结果均显示感染Ad-shRNA-ATF6后VICs中ATF6表达明显下调(P0.05)。茜素红染色表明靶向抑制体外细胞钙化模型中的ATF6表达后,钙盐沉积量显著减少(P0.05)。流式细胞检测表明ATF6干扰组和对照组的凋亡率分别为2.34±0.75%、8.56±1.08%,两者相比具有统计学意义(P0.05)。CCK-8结果表明随着培养时间的延长,VICs的生长活性增高;自第2天起,ATF6干扰组细胞的生长活性明显高于对照组(P0.05)。Western blot检测表明靶向抑制ATF6表达后,促凋亡基因Caspase-3/8、Bax表达降低,抑凋亡基因Parp表达升高,但是抑凋亡基因p-Fak表达降低。靶向抑制ATF6表达对成骨细胞表型标志物成骨转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、锌指转录因子(Osterix,OSX)的表达无明显影响。结论(一)ERS蛋白ATF6在体外细胞钙化模型和人CAVD瓣膜组织中均高表达,且ATF6与VICs凋亡呈正相关。(二)靶向抑制ATF6的表达后,能减轻钙化、减少VICs凋亡,并且抑制促凋亡相关蛋白Caspase-3/8、Bax的表达,促进抑凋亡基因Parp的表达。(三)靶向抑制ATF6表达对成骨细胞表型标志物的表达无明显影响。以上结果提示ATF6通过促进VICs凋亡推进瓣膜钙化的进展。
【图文】：

表达水平,模型,高峰,意义

图 1-1 体外 VICs 0/1/3/7 天钙化模型茜素红染色2、检测 ERS 信号通路蛋白在体外 VICs 钙化模型中的表达情况用 Western Blot 检测 VICs 钙化过程中 ERS 标志蛋白的表达，Image-J 分析灰如图 1-2 所示：if-2α 表达水平分别为：（0 天）0.72±0.07、（1 天）0.81±0.05、（3 天）0.79（7 天）0.75±0.03，表达水平第 1 天即达到高峰，随后降低；与 0 天比较，计学意义（P＞0.05）；-eif-2α 表达水平分别为：（0 天）0.64±0.28、（1 天）0.60±0.13、（3 天）0.63、（7 天）0.88±0.05，第 1 天表达水平降低，随后升高；与 0 天比较，，差异意义（P＞0.05）；bp1 表达水平分别为：（0 天）0.79±0.11、（1 天）0.87±0.07、（3 天）0.89±0.0）0.74±0.10，表达水平自第 1 天起逐渐升高，第 3 天达到高峰，后逐渐降低比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；ADD34 表达水平分别为：（0 天）0.65±0.11、（1 天）0.69±0.14、（3 天）0

阳性率,瓣膜,细胞凋亡,棕色

常与钙化主动脉瓣膜中 ATF6 表达阳性率结果中 ATF6 表达与 VICs 凋亡的相关性EL 法对 CAVD 瓣膜中细胞凋亡情况进行了验凋亡细胞核呈棕色，阳性率高，凋亡率为 84.7程中发挥一定作用。进一步分析CAVD瓣膜中关系数 r= 0.62（P < 0.0001），见图 2-2-2，呈正能通过造成细胞凋亡使主动脉瓣膜发生钙化。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.52

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