FGF21上调RACK1诱导自噬介导胆固醇流出抗动脉粥样硬化

发布时间：2020-04-24 05:41

【摘要】：脂代谢紊乱导致大量脂质在大中动脉中沉积是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的主要病理生理学基础,而巨噬细胞摄取过量的修饰脂蛋白,导致细胞内总胆固醇(Total cholesterol,TC)和甘油三酯(Triglyceride,TG)以脂滴形式积聚并形成泡沫细胞,是发生AS的重要过程。成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor21,FGF21)是一种内分泌因子,可降低血浆TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c),并提高高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-c)水平,因而具有抗AS潜力。本课题组前期研究发现FGF21可以减少泡沫细胞中的脂质蓄积,然而,潜在的机制仍不清楚。脂质蓄积是泡沫细胞形成的核心,泡沫细胞的脂滴代谢和胆固醇外流将减少泡沫细胞的形成。因此,深入探讨FGF21调节泡沫细胞脂质代谢的机制对AS的防治具有重要意义。自噬可以通过酸性脂肪酶降解脂滴,促进胆固醇流出,从而维持脂质代谢平衡;而自噬受损将抑制胆固醇逆转运,促进动脉粥样硬化的发生和发展。因此,本研究的目的是探讨FGF21是否可以通过调节自噬影响巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇代谢抗AS,并探讨其潜在机制。第一部分:FGF21对高脂饮食apo E~(-/-)小鼠AS病变的影响【目的】观察FGF21对高脂饮食apo E~(-/-)小鼠AS病变的影响。【方法】60只成年雄性apo E~(-/-)小鼠随机分成4组:(1)对照组:普通正常饮食(Normal diet,ND);(2)AS1:高脂饮食组,喂食高脂饮食(High fat diet,HFD);(3)AS2:HFD+腹腔注射(Intraperitoneal,ip)与AS3等量的生理盐水(Normal saline,NS);(4)AS3:HFD+FGF21 ip(10mg/kg.d)。每周记录体重和食物摄入量。注射12周后,在戊巴比妥诱导的全身麻醉下处死小鼠并收集血液,检测TC、TG、HDL-c和LDL-c的血浆浓度。苏丹IV染色观察主动脉AS病变。取小鼠主动脉窦作冰冻切片,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和油红O染色检测主动脉窦AS病变情况。通过上述动物实验明确FGF21对HFD apo E~(-/-)小鼠血脂谱及AS病变的影响。【结果】与对照组相比,AS1、AS2组小鼠血浆TG、TC和LDL-c水平明显升高,HDL-c明显降低(P0.05),HE、油红O染色显示小鼠主动脉窦有明显的AS斑块,苏丹IV染色可见主动脉有明显的脂质沉积,提示造模成功,并且腹腔给药途径(NS)对AS病变无明显作用(AS2与AS1比较)。HFD+FGF21组与HFD组相比,其TG、TC和LDL-c较低,HDL-c较高,AS病变面积减少,并且体重低于HFD组。【结论】FGF21可改善HFD apo E~(-/-)小鼠脂质谱并抑制apo E~(-/-)小鼠AS病变。第二部分:FGF21抗动脉粥样硬化的分子机制【目的】探讨FGF21抗AS病变的分子机制。【方法】首先明确FGF21抗AS的作用是否依赖于调节自噬的作用:90只apo E~(-/-)小鼠分为6组:(1)对照组:ND;(2)AS1:HFD;(3)AS2:HFD+NS ip;(4)AS3:HFD+FGF21 ip;(5)AS4:HFD+3-MA ip(30mg/kg.d);(6)AS5:HFD+FGF21 ip+3-MA ip。通过Western Blot检测自噬相关蛋白,HE和油红O染色检测小鼠AS病变。进而在细胞水平观察FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞自噬(流)的影响,实验分为四组:(1)对照组;(2)Baf A1组(20n M);(3)FGF21组;(4)FGF21+Baf A1组。采用Western Blot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和电镜检测分析FGF21对自噬(流)的影响。进一步分析FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响,FGF21以不同浓度(0-400ng/ml)和不同时间(0-48h)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后通过油红O染色和3H胆固醇标记分析脂质蓄积和胆固醇流出情况。为明确FGF21促进胆固醇流出是否依赖于其调节自噬的作用,采用HPLC、油红O染色和液体闪烁计数测量3H胆固醇含量分析3-MA和ATG5 si RNA抑制自噬后脂质蓄积和胆固醇流出的情况。进一步探讨FGF21上调自噬促进胆固醇流出抗AS的作用是否与蛋白激酶C受体1(Receptor for activated C kinase 1,RACK1)有关。首先通过免疫组化、RT-PCR和Western Blot检测对照组、HFD组、HFD+NS ip组和HFD+FGF21 ip组apo E~(-/-)小鼠主动脉斑块中RACK1的表达。然后,我们构建了RACK1 sh RNA慢病毒给予HFD+sh RNA组小鼠尾静脉注射,实验结束后通过Western Blot分析各组小鼠自噬水平,HE染色、油红O染色分析小鼠AS病变情况。然后,在THP-1细胞中转染RACK1 si RNA分析RACK1敲低后对自噬(流)和胆固醇流出的影响,通过Western Blot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和透射电镜检测自噬(流),HPLC、油红O染色、液体闪烁计数测量培养基和细胞中的3H胆固醇含量分析泡沫细胞中脂质蓄积和胆固醇流出情况。最后检测FGF21对AMPK磷酸化和ABCA1表达的影响,并明确其作用是否与调节RACK1有关。【结果】FGF21 ip(AS3)组与HFD组(AS1)比较LC3 Ⅱ/Ⅰ比率、Beclin1表达增加,P62表达减少;HE和油红O染色结果显示FGF21 ip组(AS3)AS病变程度低于HFD组(AS1)。3-MA+FGF21 ip(AS5)与FGF21 ip组(AS3)比较LC3 Ⅱ/Ⅰ比率、Beclin1表达水平均减少,P62表达水平增加;而HE和油红O染色结果显示自噬抑制剂3-MA+FGF21 ip组(AS5)与FGF21 ip组(AS3)相比其AS病变程度明显加重。综合以上结果表明:FGF21可通过上调HFD apo E~(-/-)自噬水平抑制AS,自噬受损削弱FGF21对AS的抑制作用。GFP-LC3、MDC染色和透射电镜测定结果显示FGF21可诱导泡沫细胞中自噬体形成。泡沫细胞与巴弗洛霉素A1共孵育时,LC3-I至LC3-II转化率相对于对照组显著增加。相对于仅用巴弗洛霉素A1或FGF21孵育组,巴弗洛霉素A1+FGF21组的LC3-I至LC3-II转化率进一步增加。因此,这些结果表明FGF21诱导泡沫细胞中的自噬流。HPLC测定结果显示,与对照组相比,200ng/ml和400ng/ml FGF21处理24小时以及200ng/ml FGF21处理24 h和48 h显著降低TC、FC和CE水平。同时,油红O染色和3H胆固醇测定结果显示FGF21促进泡沫细胞胆固醇流出、抑制脂质蓄积。3-MA或ATG5 si RNA干预处理可显著减弱FGF21促进LC3-I向LC3-II转化的作用,并相应增加P62表达。自噬体形成也被3-MA或ATG5si RNA抑制。HPLC检测表明抑制自噬明显减弱FGF21降低TC、FC和CE的作用。油红O染色和胆固醇流出检测结果显示抑制自噬减弱FGF21促进胆固醇流出并减少泡沫细胞中脂质蓄积的作用。与对照组和HFD组相比FGF21腹腔注射的HFD apo E~(-/-)小鼠RACK1蛋白和m RNA水平显著增加。与HFD+FGF21 ip apo E~(-/-)小鼠相比,HFD+FGF21ip+RACK1敲低组其LC Ⅱ/Ⅰ比率和Beclin1表达水平降低,P62表达水平增加;且与HFD+FGF21 ip apo E~(-/-)小鼠相比,RACK1敲低组其AS病变加重。在体外实验中,RACK1 si RNA抑制LC3-I向LC3-II的转化以及beclin-1的表达,同时上调P62表达水平,抑制自噬体形成。此外,RACK1敲低明显减弱FGF21对TC、FC和CE水平的降低作用,以及FGF21促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用。Western Blot结果显示FGF21可以活化AMPK增加ABCA1的表达,并且当转染RACK1 si RNA后明显减弱FGF21促进AMPK磷酸化和ABAC1表达的作用。上述结果表明,FGF21上调自噬及促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用部分依赖于RACK1。【结论】FGF21通过上调RACK1促进自噬(流)及泡沫细胞中胆固醇流出抑制apo E~(-/-)小鼠AS病变。
【图文】：

图 1. FGF21 处理对 apoE-/-小鼠 AS 病变的影响。A. 主动脉窦苏木精-伊红染色、油红 O 染色和定量分析；放大倍数为 40 倍，标尺为 25μm。数据是平均值±SEM（n = 10只/每组）， * P <0.05，与对照组比较，#P <0.05，与 AS3 组比较。B. 主动脉形态图、苏丹 IV 染色及定量；数据是平均值±SEM（n = 10 只/每组）， * P <0.05，与对照组比较，#P <0.05，与 AS3 组比较。Control：ND，AS1 组：HFD，AS2组：AS1+NS ip，AS3 组：AS1+ FGF21 ip。ND：正常饮食；HFD：高脂饮食；NS：生理盐水；ip：腹腔注射。4. 小结FGF21 可改善 HFD apoE-/-小鼠血脂谱并抑制其 AS 病变。

图 2. FGF21 促进 HFD apoE-/-小鼠自噬抑制 AS。A-C. Western Blot 检测自噬相关蛋白及定量统计。* P <0.05，AS3 与 AS1 比较；#P<0.05，AS3 与 AS5 比较，数据表示为平均值±S.D（n = 3/组）。 D-E. 主动脉窦 HE 和油红 O 染色及统计，比例尺=25μm。* P <0.05，AS3 与 AS1 比较，#P<0.05，AS3 与 AS5 比较，数据表示为平均值±SEM（n = 10 /组）。Control：ND；AS1：HFD；AS2：HFD+NS ip；AS3：HFD+FGF21 ip；AS4：HFD+3-MA ip; HFD+3MA ip+FGF21 ip；ND：正常饮食；HFD：高脂饮食；NS：生理盐水；ip：腹腔注射。3.2 FGF21 促进泡沫细胞自噬（流）最近，研究已经证实自噬对于调节脂质代谢和减少泡沫细胞中脂质蓄积至关重要[20, 21]。为了探讨自噬是否介导了 FGF21 的调脂作用，接下来在细胞水平观察了 FGF21 对自噬（流）的影响：通过检测自噬相关蛋白水平 P62 和 LC3 的表达，发现 FGF21 具有增加 LC3-I 向 LC3-II 转化和降解的作用，并抑制 P62 表达。为进一步明确 FGF21 对自噬流的影响，我们将 THP-1 细胞与巴弗洛霉素 A1 共孵育。巴弗洛霉素 A1 是进行自噬流检测的最常规和公认手段，，通过中和溶酶体PH 和抑制自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，导致自噬体堆积，此时通过Western Blot 检测到的 LC3-II 仅代表合成的自噬体和自噬溶酶体总量。泡沫细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5

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本文编号：2638591