MPNs分子遗传学与免疫特征及芦可替尼改善骨纤机制的探讨

发布时间：2020-04-29 15:52

【摘要】：背景和目的:基因突变、细胞因子、成纤维细胞均参与了MPNs的演进。骨髓纤维化(MF)是MPNs各亚型的共同疾病特征,与骨髓间充质细胞(BMMSC)、肿瘤成纤维细胞(CAF)和细胞因子有关。但目前有关影响骨髓纤维化的机制尚未阐明。本研究通过结合基因突变、T淋巴细胞亚群和细胞因子探讨MPNs的异质性,并采用芦可替尼(RUX)处理MPNs细胞,分析CAF、LOXL-2与MF演进的可能关系,为MPNs患者的治疗提供有力的理论依据。方法:1.采用高通量测序检测125例MPNs患者中127个相关基因的突变情况。2.采用流式细胞仪检测123例MPNs患者中T淋巴细胞亚群的表达水平,采用高通量蛋白芯片检测与MPNs相关的33个细胞因子的表达情况,并采用ELISA进一步验证与MF发生相关的细胞因子的含量。3.采用qPCR检测正常人和MPNs在RUX治疗前后血清中LOXL-2 mRNA的表达水平,采用Western-blot检测正常人和MPNs在RUX治疗前后骨髓中有核细胞CAF标志物(α-SMA、FAP)和血清中LOXL-2蛋白的表达水平,并分析BMMSC中a-SMA和FAP的表达水平。4.分别观察正常人和MPNs患者在RUX治疗前后BMMSC培养后细胞的形态,并评价细胞免疫表型及成骨、成脂能力的变化,检测各组细胞中a-SMA和FAP mRNA和蛋白的表达水平。结果:1.JAK2、CALR、TET2、ASXL1 和DNMT3A是MPNs患者最常见的5个基因突变;按基因功能分类,MPNs易检测到信号通路和表观调节基因突变;附加突变的异质性明显。2.MPNs患者的CD3+和CD4+T细胞在ET、PV和PMF中均减少(P0.05),PMF较ET和PV更低(P0.05);JAK2突变者的CD3+和CD4+T细胞、JAK2和CALR突变者的CD8+CD28-细胞均低于对照组(P0.05);有和无附加突变MPNs的CD3+、CD4+和CD8+CD28-细胞均较对照组减少,但后者更低(P0.05)。3.MPNs患者的IL-8、VEGF等12种细胞因子水平均较正常组高(P0.05),IL-15较正常组低(P0.05);MF明显组的IL-8和VEGF较不明显组更高(P0.05),ELISA复核IL-8和VEGF与蛋白芯片结果一致。4.MPNs患者骨髓中a-SMA、FAP及LOXL-2的mRNA和蛋白的表达水平均显著增加(P0.05),RUX治疗后a-SMA、FAP及LOXL-2的mRNA和蛋白的表达水平均显著降低(P0.05)。5.RUX治疗前后MPNs的BMMSC免疫表型和a-SMA、FAP mRNA水平较正常人无明显差异(P0.05);与正常人相比,MPNs的BMMSC中a-SMA和FAP的蛋白水平均显著增加(P0.05),经RUX治疗后,a-SMA和FAP的蛋白水平均下降(P0.05)。结论:1.MPNs驱动基因突变类型有限,而附加突变按功能分类的异质性较明显,在判断预后和疾病演进中具有重要价值,表观调节基因突变是MPNs各亚型中最常见的附加突变类型。2.本研究发现的少见基因突变与疾病的可能关系包括:SH2B3和GNAS与发病;CUX1和IKZF1与进展为白血病;CEBPA、STAG2、NF1和PTEN与疾病发展:KMT2C、PTPN11、ZRSR2和IL7R的作用未明,其中ZRSR2和IL7R在MPNs患者中鲜有报道,可为进一步研究提供线索。3.动态监测MPNs患者的淋巴细胞亚群、IL-8和VEGF的变化,在了解疾病进展、MF的程度和判定预后方面具有临床应用价值。4.在乏氧环境下RUX可能通过降低LOXL-2的表达,减少刺激MSC转化为CAF,改善MPNs患者的MF进程。
【图文】：

图１邋ＥＴ、ＰＶ和ＰＭＦ的生存期逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｍｏｎｇ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＭＰＮｓ逡逑

示意图,示意图,疾病,骨髓增殖

Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＪＡＫ／ＳＴＡＴ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑目前的理论认为：ＪＡＫ２和ＭＰＬ突变直接激活ＪＡＫ－ＳＴＡＴ通路并使骨髓增逡逑殖细胞因子持续活化或超敏（见图２），而ＬＮＫ和ＣＢＬ丧失功能的突变被认为逡逑可以消除了邋ＪＡＫ－ＳＴＡＴ的负调控。ＣＡＬＲ突变诱导的骨髓增殖的确切机制尚不清逡逑楚，但小鼠模型己经提示了其主要对血小板的生成产生影响。最近的文献表明逡逑了邋ＪＡＫ－ＳＴＡＴ激活在ＭＰＮｓ中的中心作用，，但部分概念仍未被厘清，例如，ＭＰＮｓ逡逑患者中同时存在炎症状态下的异常细胞因子表达，而这却又是癌症患者中普遍逡逑常见的非特异性现象。此外，迄今为止，使用ＪＡＫ抑制剂的“靶向治疗”未能诱逡逑导ＭＰＮｓ中疾病克隆的选择性抑制Ｍ。逡逑单一的基因突变难以解释ＭＰＮｓ患者临床表型及疾病演进的多样性和异质逡逑６逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R551.3

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