Wnt5a介导的中性粒细胞募集对压力超负荷下心脏肥大及心力衰竭的影响

发布时间：2020-04-30 03:26

【摘要】：第一部分:中性粒细胞在压力超负荷诱导的心脏肥大及心力衰竭中的作用目的:探讨中性粒细胞在非缺血性心肌损伤中的激活及作用。方法:采用小鼠横向主动脉弓缩窄(TAC)模型建立压力超负荷,诱导心肌肥厚及心力衰竭,采用Ly6G抗体注射以清除中性粒细胞。(1)分为假手术组和TAC组,于TAC术后3天,使用流式细胞仪检测骨髓中的Lin-Sca1+c Kit+(LSK)和粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)数量,心脏中募集的中性粒细胞,单核细胞和巨噬细胞数量,并测量心脏重量。(2)分为同型对照+假手术组,同型对照+TAC组,Ly6G抗体+TAC组。对小鼠进行TAC手术,并于TAC手术的对应时间点(-2,1,4,7,10,13天)注射Ly6G抗体清除中性粒细胞。分别使用超声仪检测心功能参数(PWTd,LVDd,LVDs,FS),q PCR检测ANP,BNP,β/αMHC基因的表达水平,免疫荧光染色检测心肌细胞横截面积,并测量心脏重量和胫骨长度。(3)分为同型对照+TAC组,Ly6G抗体+TAC组。对小鼠进行TAC手术,并于TAC手术的对应时间点(-2,-1,1天)注射Ly6G抗体清除中性粒细胞。采用流式细胞仪检测心脏中募集的Ly6Chi单核细胞和巨噬细胞数量。(4)分为同型对照+假手术组,同型对照+TAC组,Ly6G抗体+TAC组。对小鼠进行TAC手术,并于TAC手术的对应时间点(-2,-1,1天)注射Ly6G抗体清除中性粒细胞。采用q PCR检测Il1β,Il6,Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表达水平。结果:(1)TAC术后3天,与假手术组相比,TAC组小鼠骨髓中的LSK细胞(p0.01)和GMP细胞数量显著增加(p0.01)。(2)TAC术后3天,与假手术组相比,TAC组小鼠心脏中募集的中性粒细胞(p0.01)和单核细胞数量(p0.001)显著增加,巨噬细胞呈增加的趋势(p=0.0519)。(3)TAC术后3天,假手术组与TAC组小鼠的心脏重量无明显差异。(4)TAC术后14天,同型对照+TAC组小鼠的心脏重量/胫骨比(HW/TL)显著高于同型对照+假手术组(p0.0001),Ly6G抗体+TAC组的HW/TL相比于同型对照+TAC组小鼠显著降低(p0.001)。(5)TAC术后14天,同型对照+TAC组小鼠的心功能参数左室后壁厚度(PWTd),左室舒张期末内径(LVDd)和左室收缩期末内径(LVDs)均较基线水平显著增加且高于同型对照+假手术组(p0.01),左室短轴缩短率(FS)较基线水平显著降低且低于同型对照+假手术组(p0.0001)。Ly6G抗体+TAC组小鼠的PWTd和LVDs较同型对照+TAC组小鼠显著降低(p0.05),FS则显著升高(p0.05),与同型对照+假手术组无明显差异。(6)TAC术后14天,与同型对照+假手术组相比,同型对照+TAC组小鼠心脏的心肌损伤因子ANP,BNP,β/αMHC表达水平显著升高(p0.01)。心肌损伤因子在Ly6G抗体+TAC组小鼠中的表达水平则较同型对照+TAC组显著降低(p0.05),与同型对照+假手术组无明显差异。(7)TAC术后14天,与同型对照+假手术组相比,同型对照+TAC组小鼠的心肌细胞横截面积显著增大(p0.0001)。Ly6G抗体+TAC组小鼠的心肌细胞横截面积则较同型对照+TAC组显著降低(p0.0001)。(8)TAC术后2天,与同型对照+TAC组相比,Ly6G抗体+TAC组小鼠心脏中募集的Ly6Chi单核细胞与巨噬细胞数量均显著减少(p0.01)。(9)TAC术后2天,与同型对照+假手术组相比,同型对照+TAC组心脏中炎症因子Il1β,Il6,和趋化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表达水平均显著升高(p0.01),Ly6G抗体+TAC组小鼠心脏中该基因的表达水平则较同型对照+TAC组显著降低,其中Il1β和Ccl2基因的表达呈降低趋势,与同型对照+假手术组无明显差异。结论:中性粒细胞在心脏压力超负荷下被激活并募集至心脏中。清除中性粒细胞可缓解由压力超负荷诱导的炎症反应及心功能不全。第二部分:髓系来源的Wnt5a对中性粒细胞功能的调控及机制目的:探讨髓系来源的Wnt5a对中性粒细胞功能的调控及机制。方法:(1)建立小鼠TAC和心肌梗死(MI)模型,采用流式分选,分别从小鼠外周血分选出中性粒细胞,Ly6Chi单核细胞和Ly6Clo单核细胞,从TAC术后3天的小鼠心脏和MI术后3天的小鼠心脏中分别分选出成纤维细胞,中性粒细胞,单核细胞和巨噬细胞,并采用q PCR检测其Wnt5a基因表达水平。(2)从小鼠外周血中,采用流式分选仪分选出中性粒细胞,Ly6Chi单核细胞和Ly6Clo单核细胞,并采用q PCR检测其Frizzled(Fzd1-10)受体的基因表达水平。(3)从小鼠骨髓中提取中性粒细胞,给予不同浓度的Wnt5a刺激(0,100,500μg/ml),采用改良Boyden小室法检测中性粒细胞的迁移情况。(4)从小鼠骨髓中提取中性粒细胞,给予不同时间点(0,10,30,60min)的Wnt5a刺激(400ng/ml),采用western blotting检测PI3K,JNK1/2,Erk的蛋白磷酸化表达水平。结果:(1)Wnt5a的基因表达水平很容易地在心肌成纤维细胞,TAC术后3天的心脏中性粒细胞,和MI术后3天的心脏中性粒细胞中检测到;在TAC/MI术后的心脏巨噬细胞中仅检测到显著更低的Wnt5a基因表达;未在TAC/MI术后的心脏Ly6Chi单核细胞中检测到Wnt5a的表达;未在血液中的中性粒细胞,Ly6Chi单核细胞,Ly6Clo单核细胞检测到Wnt5a的基因表达。(2)仅在外周血中性粒细胞中检测到Fzd5受体基因的的高表达,显著高于其在Ly6Chi单核细胞和Ly6Clo单核细胞中的表达水平。(3)与未处理组相比,外源性添加Wnt5a显著刺激了中性粒细胞的迁移,且呈剂量依赖性(p0.05)。(4)与未处理组相比,外源性添加Wnt5a显著增加了PI3K,JNK和ERK的磷酸化蛋白表达水平,且在刺激30min时为表达峰值。结论:Wnt5a的髓系细胞来源是活化的中性粒细胞。Wnt5a可能作为中性粒细胞的自分泌调节剂,通过激活PI3K/JNK/ERK信号通路调控中性粒细胞的迁移等功能。第三部分:髓系特异性Wnt5a敲除对压力超负荷诱导下心脏肥大及心力衰竭的影响目的:探讨髓系特异性Wnt5a敲除在压力超负荷模型诱导下心脏肥大及心力衰竭中的作用。方法:(1)构建Wnt5a髓系细胞特异性敲除(Myelo-KO)小鼠。提取Myelo-KO小鼠骨髓来源中性粒细胞及TAC术后3天心脏中的中性粒细胞,并纯化基因组DNA,采用PCR检测Wnt5a的基因重组。(2)分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-KO+TAC组。于TAC术后0,3,7,28天分离心脏并采用流式细胞仪检测心脏中中性粒细胞,Ly6Chi单核细胞,巨噬细胞的数量。(3)小鼠分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-KO+TAC组,于TAC术后3天,采用q PCR检测心脏中炎症因子Il1β,Il6,和趋化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表达水平。(4)小鼠分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-KO+TAC组。于TAC术后不同时间点(0,2,8周)检测心脏重量/胫骨长度比(HW/TL),肺重量/胫骨长度比(LW/TL)。(5)小鼠分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-KO+TAC组。于TAC术后不同时间点(0,1,4,8周)采用超声仪检测心功能参数LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(6)在对照和Wnt5a Myelo-KO小鼠中进行假手术和TAC-8周处理,采用免疫荧光染色检测心肌细胞横截面积。(7)在对照和Wnt5a Myelo-KO小鼠中进行假手术和TAC-8周处理,采用免疫组织化学染色检测心脏间质纤维化面积。结果:(1)证实了Myelo-KO小鼠骨髓来源中性粒细胞中发生了Wnt5位点的基因重组,Wnt5a的外显子2被去除。Myelo-KO小鼠TAC术后募集至心脏中的中性粒细胞逃脱了重组酶介导的基因重组。(2)与对照组相比,Myelo-KO小鼠在TAC术后3天和7天后中性粒细胞,Ly6Chi单核细胞募集至心脏中的数量均显著降低(p0.0001),巨噬细胞募集至心脏中的数量在TAC术后7天显著降低(p0.001)。(3)TAC术后3天,与对照组相比,Myelo-KO小鼠心脏中的炎症因子及趋化因子的基因表达水平均显著降低(p0.001)。(4)与对照组相比,Myelo-KO小鼠的HW/TL在TAC术后2周和8周显著降低(p0.0001);LW/TL在TAC术后8周显著降低(p0.0001)。(5)Myelo-KO小鼠在TAC术后不同时间点(1,4,8周)的LVPWTd,LVDd,LVDs较对照组显著降低(p0.01);FS较对照组显著升高(p0.0001)。(6)Myelo-KO小鼠在TAC术后8周的心肌细胞横截面积较对照组显著减少(p0.001)。(7)Myelo-KO小鼠在TAC术后8周的心脏间质纤维化面积较对照组显著减少(p0.001)。结论:髓系特异性Wnt5a敲除显著降低了压力超负荷诱导的心脏炎症反应,显著缓解了心脏肥大及心力衰竭。第四部分:髓系特异性Wnt5a过表达对压力超负荷诱导下心脏肥大及心力衰竭的影响目的:探讨髓系特异性过表达Wnt5a对压力超负荷模型诱导下心脏肥大及心力衰竭的影响。方法:(1)构建Wnt5a髓系细胞特异性过表达(Myelo-TG)小鼠。提取对照及Myelo-TG小鼠骨髓来源中性粒细胞,分别采用q PCR检测Wnt5a基因表达水平,western blotting检测Wnt5a蛋白表达水平。(2)在对照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中进行假手术和TAC-2周处理,采用免疫组织化学染色检测心脏中的Mac2细胞表达数量。(3)在对照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中进行假手术和TAC-7天处理,采用流式细胞仪检测中性粒细胞,单核细胞,巨噬细胞募集至心脏中的数量。(4)在对照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中进行TAC,于术后3天,采用q PCR检测心脏中炎症因子Il1β,Il6,和趋化因子Cxcl1,Cxcl2,Cxcl5,Ccl2基因的表达水平。(5)小鼠分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-TG+TAC组。于TAC术后不同时间点(0,2,8周)检测HW/TL,LW/TL。(6)小鼠分为对照+TAC组,Wnt5a Myelo-TG+TAC组。于TAC术后不同时间点(0,1,4,8周)采用超声仪检测心功能参数LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(7)在对照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中进行假手术和TAC-8周处理,采用免疫荧光染色检测心肌细胞横截面积。(8)在对照和Wnt5a Myelo-TG小鼠中进行假手术和TAC-8周处理,采用免疫组织化学染色检测心脏间质纤维化面积。结果:(1)证实了Myelo-TG小鼠骨髓来源中性粒细胞中Wnt5a的基因和蛋白水平的过表达。(2)与对照组相比,Myelo-TG小鼠在TAC术后2周募集至心脏中的Mac2+阳性数量显著升高(p0.0001)。(3)与对照组相比,Myelo-TG小鼠在TAC术后7天募集至心脏中的中性粒细胞,单核细胞,巨噬细胞数量均显著升高(p0.05)。(4)与对照组相比,Myelo-TG小鼠在TAC术后3天心脏中炎症因子Il1β,Il6和趋化因子Cxcl2,Ccl2基因的表达水平均显著升高(p0.05)。趋化因子Cxcl1,Cxcl5呈增高趋势。(5)与对照组相比,Myelo-TG小鼠的HW/TL在TAC术后2周和8周显著增加(p0.01);LW/TL在TAC术后8周显著增加(p0.001)。(6)Myelo-TG小鼠在TAC术后不同时间点(1,4,8周)的LVPWTd,LVDd,LVDs较对照组显著升高(p0.001);FS较对照组显著降低(p0.0001)。(7)Myelo-TG小鼠在TAC术后8周的心肌细胞横截面积较对照组显著增加(p0.001)。(7)Myelo-TG小鼠在TAC术后8周的心脏间质纤维化面积较对照组显著增加(p0.001)。结论:髓系特异性Wnt5a过表达显著增加了压力超负荷诱导的心脏炎症反应,显著促进了心脏肥大及心力衰竭。第五部分:中性粒细胞清除对髓系特异性Wnt5a过表达在压力超负荷诱导中心脏效应的影响目的:探讨中性粒细胞清除对髓系特异性过表达Wnt5a在压力超负荷模型中心脏效应的影响。方法:(1)在对照和Myelo-TG小鼠中建立TAC模型2周,并在TAC手术的不同时间点(-2,1,4,7,10,13天)分别对各基因型小鼠进行同型对照或Ly6G抗体注射清除中性粒细胞。(1)测量各组小鼠的HW/TL。(2)采用超声仪检测各组小鼠在TAC2周后的心功能参数LVPWTd,LVDd,LVDs,FS。(3)采用q PCR检测各组小鼠在TAC2周后心脏中心肌损伤因子ANP,β/αMHC基因的表达水平。(4)采用免疫荧光染色检测各组小鼠的心肌细胞横截面积。结果:(1)在WT小鼠和Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗体的小鼠在TAC术后2周的HW/TL较注射同型对照组小鼠相比均显著降低(p0.05),且在Myelo-TG小鼠中的降低程度显著更高。(2)在Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗体使LVPWTd,LVDd,LVDs的升高降至正常水平(p0.001),FS的降低升至正常水平(p0.0001),与对照组小鼠无明显差异。(3)在Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗体使升高的心肌损伤因子ANP,β/αMHC基因的表达水平显著降低(p0.01)。(4)在WT小鼠和Myelo-TG小鼠中,注射Ly6G抗体的小鼠在TAC术后2周的心肌细胞横截面积均显著降低(p0.0001),去除了对照组与Myelo-TG组的组间差异。结论:中性粒细胞清除逆转了髓系特异性Wnt5a过表达导致的显著加剧的压力超负荷下的心脏肥大及心力衰竭。
【图文】：

40图 1.1 心脏压力超负荷对骨髓细胞的影响fects of myocardial pressure overload on bon**p <0.01大量免疫细胞募集至心脏中分析中可见髓系祖细胞在 TAC 术后 3 性粒细胞和单核细胞释放入血，且募计心脏流式实验检测 TAC 手术对心脏：与假手术组相比，TAC 手术后 3 天的

总的白细胞：CD45+中性粒细胞：CD45+, CD11b+, Ly6G+Ly6Chi单核细胞: CD45+, CD11b+, Ly6G-, Ly6Chi巨噬细胞: CD45+, CD11b+, Ly6G-, F4/80+
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.6

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本文编号：2645339