氧化三甲胺与水通道蛋白—2在高血压形成机制中相关性研究

发布时间：2020-04-30 11:24

【摘要】：心血管疾病是目前导致人类死亡的最主要原因,而高血压是心血管疾病最重要的独立危险因素。血浆氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide,TMAO)是最近发现的一种新的心血管疾病标记物,研究者发现升高的空腹血浆TMAO与主要不良心血管事件风险的增加之间存在相关性。近年来已有学者初步探索了TMAO与高血压发生发展之间的关系,研究者发现正常大鼠输入AngⅡ可使收缩压和舒张压显著升高,但仅出现在灌注的前5天;相比之下,联合输注AngⅡ和TMAO的大鼠产生的升压效应可持续到实验结束(该实验为期两周),表明TMAO可以协同AngⅡ的升压效应,但具体机制尚不清楚。TMAO是一种小型有机化合物,其化学式为(CH3)_3 NO,它通常以二水合无色固体物质形式存在。近期研究发现,在人体内,肠道菌群可以利用富含胆碱或三甲胺(Trimethylamine,TMA)结构的物质,如磷脂酰胆碱、L-肉碱等,产生TMA,而后TMA迅速经肝脏黄素单加氧酶(flavin containing mono-oxygenase,FMO)氧化生成TMAO。在人们进食富含左旋肉碱和磷脂酰胆碱的肉、蛋、奶、鱼等食物后,血液中TMAO的浓度会增加。既往我们认为富含TMAO的海鲜是地中海饮食中蛋白质和维生素的重要来源,对循环系统有益;长期以来人们也认为TMAO是胆碱代谢的废物,主要经尿液排出;然而近年来很多研究表明TMAO参与了许多从细菌到哺乳动物等生物体的重要生物学功能。最近的临床研究显示,血浆TMAO水平升高与心肌梗塞或中风等主要不良心脑血管事件风险增加呈正相关。另一方面,TMAO是一种渗透剂,在许多动、植物的细胞稳态中起着保护作用。我们知道,控制细胞体积的能力是单细胞和多细胞生物生存的关键能力,渗透剂是细胞用来维持细胞体积的小分子化合物,它们在细胞适应渗透压和静水压方面起着关键作用。细胞用于调节其体积的几种类型的渗透剂包括氨基酸及其衍生物,多元醇和糖,甲胺和尿素等;与盐离子相反,大多数渗透剂不干扰蛋白质结构。此外,一些渗透剂如TMAO似乎通过中和由渗透压、静水压或尿素等的变化所引起的蛋白质扰动来稳定蛋白质的结构与功能。有人提出,深海鱼类使用TMAO来抵消渗透压和静水压对蛋白质的不稳定作用。我们人类不断改变环境以适应自身的需要,但我们身体的各组织器官也时刻暴露于渗透压和静水压之下,由于血压的频繁变化,身体的静水压也会随时随着血压的变化而变化,从而会影响到心、脑、肾及全身动、静脉细胞的结构和功能。例如,在人体肾脏髓质的细胞环境中,为了产生浓缩的尿液,肾脏在髓质区域积聚钠和尿素以建立高的渗透梯度,其渗透压要比血浆的渗透压高三至五倍。有报道称,肾脏髓质也积聚TMAO,它可以作为渗透剂,保护肾脏细胞的蛋白质免受尿素所引起的干扰。肾脏最主要的功能,就是调节体内水与渗透压的平衡。对水通过生物细胞膜的方式的研究发现,细胞膜的双层脂质结构可以经简单的扩散模式透过水分,但人们发现,肾脏的髓袢降支细段以及集合管部分,他们对水的通透性可以比其他肾脏部位对水的通透性高出数十倍乃至数百倍,氯化汞可以抑制这种水的快速转运的功能,而β-巯基乙醇可以使这种快速转运的功能被还原。人们从而推定特定的生物膜的水通道在细胞膜上可能是存在的。第一个水通道蛋白(Aquaporin,AQP)在20世纪80年代后期被发现,并被命名为Aquaporin1(AQP1);进而AQP家族的新成员在哺乳动物中被相继发现,至少有13种AQPs之多(即:AQP0-AQP12),人们研究发现,体内含AQP量最高的器官是肾脏,至少发现有7种亚型的表达(AQP1-AQP4,AQP6,AQP7,AQP11)。其中水通道蛋白-2(aquaporin-2,AQP-2)主要分布于肾脏集合管,由于AQP-2在尿液形成的终末端表达,并通过血管加压素(Arginine Vasopressin,AVP;也称抗利尿激素Antidiuretic hormone,ADH)调节,所以AQP-2是肾脏的一种关键性水通道蛋白。对AQP-2的研究发现,它主要分布在肾脏的集合管主细胞的顶端膜以及主细胞胞浆中的囊泡膜上,在肾脏浓缩机制中AQP-2起了很重要作用。在一般状态下,AQP-2主要储存于主细胞胞浆的囊泡膜上,当血管加压素(AVP)刺激后,AQP-2从主细胞的囊泡膜上转移至细胞膜的顶端,通过细胞膜与囊泡膜的融合,实现AQP-2在顶端膜表达。AVP刺激后,AQP-2表达在了主细胞的顶端膜,其对水的通透性发生了改变,水很容易的从集合管主细胞顶端膜转移到主细胞胞浆中,从而水的重新吸收得以实现。以往的多数研究集中于AQP-2经AVP刺激后转运到顶端膜,从而调节了细胞膜对水的通透性;然而这里一直存在着这样一个疑问:就是如果AQP-2仅仅表达在主细胞的顶端膜,那么大量的水分经过表达在顶端膜的AQP-2快速水通道进入细胞内,但是如果没有很好的水分排出并吸收入血的通道,集合管主细胞在短时间里承受巨大的水进入的压力,会导致细胞肿胀,细胞内的各类细胞器受损,甚至迅速导致细胞的死亡。许多研究只关注集合管主细胞顶端膜AQP-2开放,而未同步关注进入集合管主细胞的水分经哪里进入血液。随后有研究发现,在大多数情况下,细胞内AQP-2经AVP激素刺激后不仅转移到主细胞的顶端膜;而且AQP-2同时也转移到了主细胞的基底膜;研究者~([23])用免疫组化法,在免疫电子显微镜下观察并计数金颗粒的数量,详细的揭示了在正常条件下及AVP不存在的条件下,AQP-2在集合管主细胞顶端膜和基底膜的精确定位,观察到AQP-2呈轴向非均质性表达;进一步的计算及显微镜观察发现AQP-2主要定位于肾小管细胞的内髓集合管主细胞的顶端膜及基底外侧膜上,而很少的一些AQP-2定位在了肾脏皮质的集合管主细胞的顶端膜和基底膜。这样我们可以解释AQP-2不仅表达在主细胞的顶端膜,同时也表达在主细胞基底侧膜上,相当于在集合管主细胞上建立起一个横向沟通集合管与血管的快速水通道,水经AQP-2进入集合管主细胞,然后又迅速吸收入血液,这样就保证了集合管主细胞的体积、形状及功能的稳定与平衡,以及肾脏内髓集合管对水的快速重吸收。既往有研究表明TMAO在肾脏有聚集现象,TMAO的升高是否会调节AQP-2的表达及开放,从而起到调节水代谢及参与渗透压调节等功能呢?二者的相关机制尚需进一步研究。综上所述,TMAO是渗透性小分子,在肾脏有聚集的现象,与渗透压的变化可能存在关系,经肾脏排泄;同时TMAO有稳定蛋白质结构与功能的作用,近期有研究提示TMAO可以协助AngⅡ起到延长升压持续时间的作用;而AQP-2在调节水代谢及维持渗透压的变化中起着非常重要的作用。这些重要特征表明,TMAO所致的血压上调的机制可能与AQP-2调节水代谢及维持渗透压变化的作用机制之间存在密切的关系。本研究旨在探讨自发性高血压大鼠血浆TMAO水平,评估TMAO对自发性高血压大鼠动脉血压(BP)的影响;并在细胞水平进一步探究TMAO与AQP-2在高血压形成中的相互作用及分子机制研究,可能为临床中预防及治疗高血压提供基本的干预策略,将心血管疾病的预防前移,减少高血压及心脑血管疾病的发生。第一部分氧化三甲胺(TMAO)对自发性高血压大鼠肾脏水通道蛋白-2表达的影响目的:本研究的目的是探讨自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)的血浆TMAO水平,及TMAO与AQP-2在高血压形成机制中的相关关系。方法:将12周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR,n=40)和Wistar-Kyoto大鼠(WKY,n=40)分为SHR组和WKY组。SHR大鼠随机分配到四组(每组10只)(1)SHR Untreated组:等量的生理盐水灌胃给药作为对照,每天一次经口灌胃给药;(2)SHR TMAO组:0.24%TMAO(普通饲料含有0.24%TMAO,wt/wt),每天一次经口灌胃给药;(3)SHR TMAO+TVP组:0.24%TMAO,每天一次经口灌胃给药;并加用托伐普坦(Tolvapan,TVP,一种V2受体拮抗剂)以15mg/kg灌胃给药,每日两次;(4)SHR TVP组:TVP以15mg/kg灌胃给药,每日两次;同时将WKY大鼠随机分为四组(每组10只):(5)WKY Untreated组:等量的生理盐水灌胃给药作为对照,每天一次经口灌胃给药;(6)WKY TMAO组:0.24%TMAO,每天一次经口灌胃给药;(7)WKY TMAO+TVP组:0.24%TMAO,每天一次经口灌胃给药;并加用TVP以15mg/kg灌胃给药,每日两次;(8)WKY TVP组:TVP以15mg/kg灌胃给药每日两次。试验共持续6周,每周测定血压(BP);每周收集SHR和WKY大鼠空腹状态下尾静脉血液样品,用液相色谱法与三重四极杆质谱联用测定血浆TMAO表达,检测血浆渗透压(POsm),ELISA法检测血浆血管加压素(PAVP)和血浆水通道蛋白-2(PAQP-2)浓度,RT-PCR和Western blot检测AQP-2在肾脏中的表达。结果:从第12周至第17周,SHR Untreated组和WKY Untreated组大鼠血浆TMAO浓度无显着性差异;从实验的第14周到第17周,与SHR Untreated相比,SHR TMAO组大鼠血浆TMAO浓度、POsm、PAVP及SBP均有显着增加;经TVP干预后,与SHR TMAO组相比,SHR TMAO+TVP组大鼠的血浆TMAO浓度、POsm及SBP均有显着下降,而PAVP出现明显的升高,P0.05,差异具有统计学意义。SHR大鼠经TMAO干预后,PAQP-2水平,AQP-2mRNA及AOP-2蛋白质的表达水平均明显升高;而经V2受体拮抗剂TVP干预后,PAQP-2水平,AQP-2mRNA及AOP-2蛋白质的表达水平均明显下降,P0.05,差异具有统计学意义。在WKY组中也观察到相类似的变化趋势,但WKY组大鼠的血浆TMAO浓度、POsm、PAVP和PAQP-2等参数变化相应较晚,但变化趋势相同;WKY组中RT-PCR和Western blot检测AQP-2mRNA及AQP-2蛋白均在肾脏髓质中的表达,但检测AQP-2表达量相对于SHR组较少。结论:血浆中TMAO水平的增加导致血浆渗透压的升高,触发AVP的释放,导致AQP-2表达增加,引起水分重吸收增加,促使血容量增加,最终导致血压升高。第二部分氧化三甲胺对水通道蛋白-2作用机制的研究目的:建立稳定表达AQP-2的HEK293细胞株,进一步探讨TMAO对HEK293/AQP-2中AQP-2表达的影响,及TMAO与AQP-2相互作用机制。方法:1.稳定表达pc DNA3-AQP-2细胞株构建:采用Lipofectamine 2000将pc DNA3-AQP-2质粒转染至HEK293细胞中,采用Western blot技术、RT-PCR法、免疫荧光法证实稳定表达pc DNA3-AQP-2细胞株构建成功。2.不同浓度TMAO干预稳定表达pc DNA3-AQP-2细胞株,分组:(1)HEK293control组:用浓度梯度为(0、2、4、20、40、200、400)μmol/L的TMAO进行干预;(2)HEK293/Veckor组:用浓度梯度为(0、2、4、20、40、200、400)μmol/L的TMAO进行干预;(3)HEK293/AQP-2组:用浓度梯度为(0、2、4、20、40、200、400)μmol/L的TMAO进行干预,从不同浓度TMAO干预稳定转染pc DNA3-AQP-2的HEK293细胞株,找出促进AQP-2表达的最佳TAMO浓度,Western blot技术、RT-PCR技术检测AQP-2的表达。3.最佳TMAO浓度作用下,给与V2受体拮抗剂TVP进一步探究TMAO与AQP-2相互作用机制,分组:稳定转染HEK293/AQP-2细胞:分组:(1)control组:空白对照组,(2)TMAO组:20μmol/L的TMAO,(3)TVP+TMAO组:10μM的TVP+20μmol/L的TMAO,(4)TVP组:10μM的TVP,RT-PCR及Western blot技术-检测HEK293/AQP-2细胞上AQP-2、V2受体、c AMP,PKA等的m RNA及蛋白的表达水平。结果:Western blot、RT-PCR、免疫荧光结果表明,pc DNA3-AQP-2受体在HEK293细胞系中成功表达,成功建立了稳定表达pc DNA3-AQP-2的HEK293细胞株;稳定表达pc DNA3-AQP-2的HEK293细胞株经不同浓度TMAO干预后,出现随TMAO浓度升高,诱导AQP-2表达增加的现象;差异具有统计学意义,P0.05;但当TMAO浓度高到200μmol/L时,出现转染pc DNA3-AQP-2及HEK293/Vector细胞株死亡。选择最佳TMAO浓度在稳定表达pc DNA3-AQP-2的HEK293细胞株进行干预后,TMAO组出现AQP-2、V2受体、c AMP,PKA等的m RNA及蛋白的表达的增加,经TVP预处理30分钟后,再加入TMAO,出现AQP-2、V2受体、c AMP,PKA等的m RNA及蛋白的表达的减低,差异具有统计学意义,P0.05。结论:成功建立了稳定表达pc DNA3-AQP-2的HEK293细胞株;随TMAO浓度升高,诱导AQP-2表达增加,但TMAO浓度过高时导致细胞株死亡,TMAO浓度增加,可激活AQP-2的V2受体,进而促使胞内c AMP-PKA通路活化,使含AQP-2的囊泡向细胞膜表面移动增加,AQP-2细胞膜表达增加,细胞对水通透性增加;过高TMAO浓度时水通透性增加过多,导致细胞内失水增加,细胞皱缩、死亡;TVP可抑制TMAO升高AQP-2表达的作用,及细胞皱缩等现象均明显减轻。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1

【相似文献】