硒蛋白S缓解肿瘤坏死因子-α诱导血管内皮细胞功能障碍的作用及机制

发布时间：2020-05-02 17:56

【摘要】：背景:动脉粥样硬化(AS)是一种以脂质异常聚积动脉管壁为典型特征的病理学表现,其引发的心脑血管系统疾病正严重危害人类健康与生命。其中内皮功能障碍(ED)被认为是AS形成发展过程中启动环节之一,改善和预防内皮细胞功能紊乱一直是防治AS的探讨热点和研究难点。硒蛋白S(Sel S)是一种位于内质网膜上的单次跨膜蛋白,其组织分布广泛,在肝脏、脂肪、骨骼肌、肾脏、胰岛及血管等器官组织中均有表达。Sel S主要生物学功能包括调节内质网应激、抵抗氧化应激、调控炎症反应及参与糖脂代谢。在促炎症因子中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是代谢性疾病及炎症性疾病中致ED关键影响因子之一,目前Sel S在血管内皮细胞功能紊乱中的作用尚不清楚,故本研究探讨Sel S对TNF-α诱导内皮功能紊乱的影响及其相关机制。方法:高脂饮食(HFD)喂养低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLR KO)小鼠16周,免疫组化检测该小鼠主动脉含生长因子样模体粘液样激素样受体(EMR1,又称F4/80)、肿瘤坏死因子受体-1(TNFR-1)、磷酸化的核因子-κB p65(p-NF-κB p65)及Sel S表达水平;应用外源性重组人TNF-α及相关通路抑制剂处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用蛋白免疫印迹及实时定量聚合酶链式反应等方法观察TNF-α诱导HUVECs功能紊乱的情况并明确TNF-α诱导HUVECs功能紊乱的分子机制;应用DNA重组技术构建pc DNA3.1-Sel S重组质粒及RNA干扰技术构建Sel S特异性小干扰RNAs以调控内皮细胞Sel S表达,从而研究Sel S对TNF-α诱导血管内皮细胞功能紊乱的影响及相关机制。结果:HFD喂养的LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区炎性指标及Sel S表达升高:与普通饮食喂养小鼠相比,HFD喂养的LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区F4/80表达增多(0.11±0.01 vs 0.06±0.01,p0.01)、TNFR-1表达增多(0.010±0.004 vs 0.003±0.003,p0.01)、p-NF-κB p65表达增多(0.010±0.004 vs0.003±0.002,p0.01)及Sel S表达增多(0.06±0.02 vs 0.010±0.004,p0.01)。TNF-α诱导血管内皮细胞功能紊乱:与对照组比较,TNF-α组细胞存活率降低[(53.93±11.20)(%)vs(93.42±7.63)(%),p0.01]、一氧化氮(NO)含量降低(1.07±0.22 mmol/ml vs 2.12±0.28 mmol/ml,p0.01)、内皮型一氧化氮合酶(e NOS)m RNA水平下降(0.56±0.11 vs 1.01±0.16,p0.05)、e NOS蛋白表达减少(0.55±0.17 vs 2.17±0.23,p0.01),而内皮素-1(ET-1)m RNA水平升高(6.45±1.06 vs 0.93±0.64,p0.01)、活性氧自由基(ROS)产生增多(220.36±40.95vs 117.66±16.27,p0.01)。与对照组比较,TNF-α组单核细胞粘附到内皮细胞数量增多(554±111.45 vs110±13.45,p0.01)、细胞上清细胞间粘附分子-1(s ICAM-1)水平升高(56.97±8.12 pg/ml vs 12.23±4.43 pg/ml,p0.01)、上清血管细胞粘附分子-1(s VCAM-1)水平升高(150.13±22.30 pg/ml vs 17.56±9.08 pg/ml,p0.01),TNF-α组细胞ICAM-1 m RNA水平升高(12.31±2.01 vs 1.03±0.66,p0.01)、VCAM-1m RNA水平升高(25.74±4.54 vs 0.90±0.63,p0.01)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)m RNA水平升高(5.61±1.18 vs 0.97±0.21,p0.01)、白介素-8(IL-8)m RNA水平升高(3.39±0.53 vs 1.07±0.22,p0.01)、白介素-6(IL-6)m RNA水平升高(4.76±1.06 vs 1.00±0.49,p0.01)、白介素-1β(IL-1β)m RNA水平升高(3.00±0.45vs 1.00±0.45,p0.01)。TNF-α诱导血管内皮损伤与p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)和核因子-κB(NF-κB)通路激活的关系:与对照组比较,TNF-α组细胞p-p38 MAPK表达增多(1.23±0.27 vs 0.29±0.12,p0.01)、下游磷酸化的原癌基因(p-c-jun)表达增多(0.85±0.15 vs 0.11±0.07,p0.01),磷酸化的κB抑制蛋白α(p-IκBα)表达增多(0.87±0.14 vs 0.28±0.17,p0.01)、磷酸化的IκBα激酶β(p-IKKβ)表达增多(0.61±0.13 vs 0.17±0.22,p0.05)、胞核NF-κB p65表达增多(1.32±0.24vs 0.69±0.16,p0.01),而胞浆NF-κB p65表达减少(0.39±0.17 vs 1.22±0.24,p0.01)。与TNF-α组相比,应用p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)后细胞ICAM-1蛋白表达减少(0.10±0.09 vs 0.95±0.17,p0.01)、VCAM-1蛋白表达减少(0.59±0.24 vs 2.56±0.35,p0.01)、IL-6 m RNA水平下降(2.66±0.74 vs5.24±0.96,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.47±0.69 vs 3.29±0.69,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(2.33±0.83 vs 7.73±0.10,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.30±0.23 vs 3.94±0.72,p0.01),应用NF-κB通路抑制剂(S2882)后细胞ICAM-1蛋白表达减少(0.12±0.11 vs 0.95±0.17,p0.01)、VCAM-1蛋白表达减少(0.08±0.09 vs 2.56±0.35,p0.01),IL-6 m RNA水平下降(1.81±0.76 vs5.24±0.96,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.19±0.66 vs 3.29±0.69,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(1.85±1.23 vs 7.73±0.10,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.32±0.32 vs 3.94±0.72,p0.01)。高表达Sel S在TNF-α诱导血管内皮损伤中的作用及其机制:与TNF-α+E-Vector组相比,TNF-α+pc-Sel S组细胞存活率升高[(81.76±1.47)(%)vs(51.37±11.30)(%),p0.01]、NO含量增多(1.71±0.31 mmol/ml vs 1.08±0.26mmol/ml,p0.01)、e NOS m RNA水平升高(0.81±0.10 vs 0.53±0.18,p0.05)、e NOS蛋白表达增多(1.30±0.22 vs 0.50±1.06,p0.01),而ET-1 m RNA水平下降(3.64±0.99 vs 6.65±1.05,p0.01)、ROS释放减少(126.20±31.72 vs221.63±40.27,p0.01)。与TNF-α+E-Vector组相比,TNF-α+pc-Sel S组单核细胞粘附到内皮细胞数量减少(297±105.87 vs 554±111.45,p0.01)、s ICAM-1水平下降(32.11±10.17 pg/ml vs 57.66±17.61 pg/ml,p0.01)、s VCAM-1水平下降(100.79±17.65 pg/ml vs 153.66±25.37 pg/ml,p0.01),细胞ICAM-1 m RNA水平下降(5.34±2.40 vs 12.31±2.42,p0.01)、VCAM-1 m RNA水平下降(14.60±4.61vs 26.41±4.56,p0.01)、IL-6 m RNA水平下降(2.14±0.60 vs 4.83±0.98,p0.01)、IL-1βm RNA水平下降(1.62±0.41 vs 2.98±0.42,p0.01)、MCP-1 m RNA水平下降(2.18±0.75 vs 5.62±1.08,p0.01)、IL-8 m RNA水平下降(1.34±0.50 vs3.27±0.82,p0.01),细胞p-p38 MAPK表达减少(0.59±0.17 vs 3.27±0.82,p0.01)、p-c-jun表达减少(0.33±0.11 vs 0.86±0.15,p0.01)、p-IKKβ表达减少(0.10±0.01 vs 0.61±0.13,p0.01)、p-IκBα表达减少(0.42±0.11 vs 0.87±0.14,p0.01)、胞核NF-κB p65表达减少(0.38±0.20 vs 1.17±0.18,p0.01),而细胞胞浆NF-κB p65表达增加(0.90±0.12 vs 0.25±0.15,p0.01)。低表达Sel S在TNF-α诱导血管内皮损伤中的作用及其机制:与TNF-α+Neg.RNA组相比,TNF-α+Sel S si RNA组细胞存活率降低[(26.57±7.62)(%)vs(52.27±13.17)(%),p0.01]、NO含量降低(0.46±0.15 mmol/ml vs1.02±0.23 mmol/ml,p0.01)、e NOS m RNA水平下降(0.18±0.12 vs 0.52±0.15,p0.01)、e NOS蛋白表达减少(0.08±0.07 vs 0.63±0.22,p0.01),而ET-1 m RNA水平升高(9.35±1.03 vs 6.73±1.30,p0.01)、ROS释放增多(352.20±31.82 vs211.84±41.46,p0.01)。与TNF-α+Neg.RNA组相比,TNF-α+Sel S si RNA组单核细胞粘附到内皮细胞数量增多(1371±98.51 vs 554±102.69,p0.01)、s ICAM-1水平升高(93.10±10.14 pg/ml vs 60.52±10.51 pg/ml,p0.01)、s VCAM-1水平升高(276.73±20.06 pg/ml vs 164.00±18.62 pg/ml,p0.01),细胞ICAM-1 m RNA水平升高(25.75±5.49 vs 12.43±4.73,p0.01)、VCAM-1 m RNA水平升高(46.33±5.93 vs 25.42±7.74,p0.01)、IL-6 m RNA水平升高(8.71±1.44 vs4.92±0.93,p0.01)、IL-1βm RNA水平升高(6.26±0.87 vs 3.10±1.03,p0.01)、MCP-1 m RNA水平升高(9.14±1.35 vs 5.32±1.57,p0.01)、IL-8 m RNA水平升高(5.25±1.21 vs 3.03±0.80,p0.01),细胞p-p38 MAPK表达增多(1.87±0.23 vs1.14±0.35,p0.01)、p-c-jun表达增多(1.76±0.18 vs 1.15±0.30,p0.01)、p-IKKβ表达增多(0.68±0.09 vs 0.20±0.05,p0.01)、p-IκBα表达增多(1.20±0.27 vs0.82±0.08,p0.05)、胞核NF-κB p65表达增多(1.42±0.17 vs 0.78±0.22,p0.01),而细胞胞浆NF-κB p65表达减少(0.08±0.04 vs 0.63±0.20,p0.01)。结论:HFD喂养的LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区Sel S表达增加,说明Sel S可能参与AS的反应进程。TNF-α引起血管内皮细胞功能紊乱并激活p38 MAPK和NF-κB信号通路,应用p38 MAPK通路抑制剂和NF-κB通路抑制剂后减轻TNF-α诱导的内皮损伤,说明TNF-α通过激活p38 MAPK和NF-κB信号通路诱导内皮细胞功能紊乱。高表达Sel S抑制TNF-α诱导的内皮损伤及p38 MAPK和NF-κB通路激活,低表达Sel S促进TNF-α诱导的内皮损伤及p38 MAPK和NF-κB通路激活,说明Sel S在TNF-α诱导的内皮损伤中发挥保护作用并且与其影响p38 MAPK和NF-κB信号通路的激活相关。Sel S可能成为防治血管内皮损伤研究的新靶点,尤其在以炎症反应贯穿始终、以内皮损伤为关键环节的AS中得以体现。
【图文】：

情况,斑块,中膜平滑肌,高脂饮食

而 HFD 组 LDLR KO 小鼠主动脉可见其斑块明显地朝向内膜凸起，斑块的纤维帽下可见大量坏死物质，斑块处中膜平滑肌也因受压而萎缩（图 1）。图1 各组LDLR KO小鼠主动脉H&E染色情况RCD：普通饮食；HFD：高脂饮食。

粥样硬化

2. 高脂喂养的LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区炎性指标表达升高HFD 组 LDLR KO 小鼠主动脉粥样硬化病变区 F4/80 表达（0.11±0.01）较RCD组（0.06±0.01）明显升高（p＜0.001，图2A及图2B）。与RCD组（0.003±0.003）相比，HFD组LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区TNFR-1表达（0.010±0.004）显著增加（p＜0.01，图 2C 及图 2D），同时在 HFD 组 LDLR KO 小鼠主动脉粥样硬化病变区 p-NF-κB p65 表达（0.010±0.004）较 RCD 组（0.003±0.002）表达上调（p＜0.01，，图 2E 及图 2F）。图2 各组LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区炎性指标表达A：在RCD组和HFD组中LDLR KO小鼠主动脉粥样硬化病变区F4/80表达；B：Image Pro Plus
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

【参考文献】