Junctophilin-2调节心房肌细胞内钙稳态及心房重构影响房颤发生的作用机制研究

发布时间：2020-05-05 18:15

【摘要】：一、研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常,并伴有较高的致残率和致死率。AF可逐渐由阵发性房颤(paroxysmal AF)进展为持续性房颤(persistent AF),是缺血性脑卒中、充血性心力衰竭及全因性死亡率增加的主要危险因素。目前AF的具体发生机制尚不明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。Calpain是一类钙离子依赖激活的半胱氨酸蛋白酶,在钙超载时其可转位至胞膜上并大量激活,水解一些蛋白底物,引起细胞结构和功能的破坏。近来研究发现,房颤患者心房肌组织中激活的Calpain-1可酶解L-型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)、钠钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)等多种心肌细胞内离子通道及结构蛋白。近期发现,位于心肌横管膜(transverse tubules,T-tubules)与肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)膜之间的膜偶联结构蛋白——亲联蛋白2(junctophilin-2,JP2)可以通过稳定肌浆网钙通道雷尼丁受体2(ryanodine receptor 2,RyR2)而发挥调节心肌细胞内钙稳态的作用,而钙稳态异常被认为是AF发生发展的重要机制之一。此外,在缺血再灌注损伤、心力衰竭等动物模型中,均发现JP2蛋白可被激活的Calpain-1所降解,提示JP2也是Calpain-1的降解底物蛋白之一。因此我们推测,在心房快速搏动、氧化应激等刺激条件下,心房肌内Calpain-1激活可通过降解重要钙稳定蛋白JP2等底物,促进房颤的发生与维持;而维持正常水平的JP2蛋白可减少RyR2的异常钙泄漏,抑制延迟后除极(delayed afterdepolarization,DAD)等电触发活动、以及可能的心房重构的发生,从而发挥其维持正常心律的关键作用。二、研究目的(一)明确JP2及Calpain-1在房颤患者及实验性房颤模型中的表达规律(二)阐明Calpain-1抑制剂通过调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制(三)探讨JP2蛋白水平变化影响小鼠房颤易感性的作用及机制研究三、研究方法(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化规律研究1.收集于我科行体外循环下冠状动脉搭桥术或者二尖瓣外科手术患者的心房肌标本,其中术前诊断为持续性AF者28例,维持正常窦性心律(normal sinus rhythm,NSR)者16例,于体外循环转机前采集标本,迅速转移至医院生物样本库。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。2.选取共计18只成年新西兰大白兔(2.0~2.5 kg,雄性)为实验对象,按照随机数法分别纳入假手术组(sham)和RAP组(2 w、4 w),其中每组6只。沿胸骨左缘第3肋间打开胸腔,暴露心脏,将起搏电极头端缝合固定于左心房游离壁.起搏电极尾端缝合固定于胸腹壁位置上并通过皮下与起搏器相接。起搏器起搏模式为AOO,刺激频率为1000 bpm,连续刺激4 w,以建立快速心房起搏(rapid atrial pacing,RAP)兔AF模型。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.实验动物的选择及分组本实验中,我们采用诱导性基因调控“Tet-off”系统构建心脏特异性Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)模型,作为房颤小鼠实验模型。在该系统中融合表达四环素(Tetracycline,Tet)调控的转录激活子(tet-controlled transcriptional activator,tTA),在缺少四环素或者强力霉素(doxycycline,Dox)时,tTA可以激活目的质粒转录;在四环素或者强力霉素作用下,缺少增强子使目的基因表达量很低或无法表达。开展作用及机制研究的时间点为撤除Dox药物饲料(即Tet-off系统开始目的基因过表达)后8周。在该时间点,分为以下三组,即对照组(control),Calpain-1过表达组(CAPN 1-OE),以及Calpain-1过表达同时给予Calpain抑制剂(MDL28170,10 mg/kg,1/日,腹腔注射)处理组(CAPN 1-OE+MDL)。本部分纳入实验小鼠共计75只,其中选择无Calpain-1过表达的αMHC-tTA小鼠(Calpain/tTA-/+)作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+),雌雄不限,共计50只,采用随机数字法分为CAPN1-OE组和CAPN 1-OE+MDL组,每组25只。2.Calpain抑制剂调控小鼠房颤易感性的作用研究采用STG-3008型多通道电刺激器(MultiChannel Systems,Germany),通过连接Millar 1.1F多电极电生理导管(EPR-800,Millar Instruments),外接Labchart Pro信号采集系统(AD Instruments,Australia)同时记录心脏表面电信号和体表心电图,明确食管腔内电刺激导管的合适位置,开展经食管心脏程序性电刺激和记录。采用经食管心脏程序性电刺激方法检测各组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。3.标本收集完成相应电生理检测后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测各组心房组织JP2表达变化;采用活性检测试剂盒,评估各组心房组织Calpain 1的酶活性。4.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞钙稳态的机制研究通过Langendorff灌流酶解法成功分离成年小鼠心房肌细胞,进行5μM Fluo-4AM钙荧光标记后在激光共聚焦显微镜下检测钙稳态变化情况。激发波长/发射波长分别为488 nm/505 530 nm。刺激强度15 V/cm,频率1 Hz的规律电刺激暂停5 s后,检测钙火花(Ca~(2+)sparks)发生频率的变化。在此基础上,为了进一步明确撤药4周时JP2-OE的保护作用机制,采用钙指示剂(5μM Rhod-2 AM)小鼠心脏整体灌流的方法,原位观察整个心房组织(in situ whole heart imaging)的钙稳态异常,如钙波(Ca~(2+)waves)的发生频率情况。5.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞电重构的机制研究采用经食管心脏程序性电刺激方法,行S1S2刺激,比较心房有效不应期(atrial effective refractory period,AERP)的变化情况;采用心脏整体灌流心肌细胞膜荧光指示剂(5μM MM 4-64)30 min后,原位观察整个心房组织横管(Transverse tubules,T-tubules)结构的变化情况。6.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌结构重构的机制研究在进行完相应电生理实验之后,剪取小鼠心房肌组织称重(atrium weight),测量小鼠胫骨长度(tibia length),计算心房重量/胫骨长度(atrium weight/tibia length,AW/TL);小鼠心脏4%PFA灌流固定处理后,采用Masson trichrome染色法,检测小鼠心房纤维化程度;剪取小鼠心房肌标本,采用Western blot检测心房中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1,α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA),以及I型胶原蛋白(collagen I,Col I)等经典促纤维化信号通路的蛋白表达变化。(三)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.心肌特异性JP2过表达小鼠、Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型的构建本实验中,我们首先构建了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE),并将其与业已建立的Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)杂交,以产生Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.实验动物的选择及分组按照基因型不同,本部分实验分为以下三组,即对照组小鼠(control),Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)以及Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。共计纳入小鼠75只,其中选择有且仅有tTA基因阳性表达,即Calpain/tTA-/+或Calpain/JP2/tTA-/-/+的基因型小鼠作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择仅Calpain-1心脏特异性过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN1-OE组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1/JP2共同过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN 1-OE×JP2-OE组,雌雄不限,共计25只。在此基础上,按照撤除Dox药物饲料(即Calpain或者Calpain/JP2过表达激活)的时间,再细分为撤Dox饲料4周组(Dox withdrawal 4 w),以及撤Dox药物饲料8周组(Dox withdrawal 8 w)。每个时间段的系列实验动物分组同上,因此本部分实验共计纳入小鼠150只。3.各组小鼠心功能基线变化情况电生理实验开始之前,利用超声心动图检测各组小鼠心脏功能的变化情况,如左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF),收缩末左室容积(end-systolic volume,ESV),以及舒张末左室容积(end-diastolic volume,EDV)等;并评估整体心脏重构改变,比较各组小鼠心脏重量/体重(heart weight/body weight,HW/BW)以及肺脏重量/体重(lung weight/body weight,LW/BW)的变化情况。4.JP2过表达对小鼠房颤易感性的作用研究实验方法同第二部分。在相应的时间点,采用经食管心脏程序性电刺激,首先行不同基础刺激周长(basic cycle length,BCL)的连续短阵S1S1刺激,比较标准窦房结恢复时程(corrected sinus node recovery time,cSNRT)的变化情况,评价窦房结功能变化;采用burst电刺激方案,检测三组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。5.标本采集完成相应电生理实验之后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测心房中JP2及Calpain-1的蛋白表达水平变化;采用钙蛋白酶Calpain活性检测试剂盒,评估各组小鼠心房肌组织中Calpain 1的酶活性变化情况。6.JP2调节CAPN 1-OE小鼠钙稳态的机制研究实验方法同第二部分。检测各组小鼠心房肌细胞钙火花发生频率变化情况;采用钙荧光指示剂心脏整体灌流方法,原位观察心房组织的钙波等钙泄漏事件发生情况。7.JP2调控CAPN 1-OE小鼠心房电重构的机制研究经食管心脏电刺激程序同第二部分。检测各组小鼠心房有效不应期AERP的变化情况;采用离体心脏原位T管成像技术,检测左右心房组织T管结构重构情况。8.JP2调节CAPN 1-OE小鼠结构重构的机制研究实验方法同第二部分。采用大体标本成像、心房重量/胫骨长度AW/TL评价三组小鼠心房腔扩大情况;采用Masson染色法,检测各组小鼠心房纤维化程度;采用Western blot方法,检测各组小鼠心房组织中TGF-β1,α-SMA,以及Col I的蛋白表达水平变化。四、研究结果(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化及相关性研究1.房颤患者心肌标本中JP2及Calpain-1的表达规律持续性房颤患者心房肌组织中JP2蛋白表达水平显著下降,Calpain-1蛋白水平及其酶活性均显著升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关。2.快速心房起搏兔房颤模型中JP2及Calpain-1的表达规律在RAP兔房颤模型中,随着高频心房起搏时程延长,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐下降,Calpain-1蛋白水平及酶活性逐渐升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.Calpain抑制剂显著改善CAPN 1-OE小鼠异常升高的房颤易感性同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠其房颤的诱发率显著升高,房颤事件持续时长明显延长。而在撤除Dox药物饲料即日起,开始腹腔注射Calpain抑制剂MDL28170,结果提示,CAPN 1-OE+MDL处理组中,小鼠房颤诱发率、持续时间的异常升高均明显改善。2.Calpain抑制剂显著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌Calpain-1的过度激活同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌组织Calpain 1的酶活性显著升高,伴有JP2蛋白表达水平明显下降,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌组织中的Calpain1的酶活性显著降低,而JP2蛋白表达水平得以明显恢复。3.Calpain抑制剂显著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞异常钙稳态同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌细胞钙火花异常增多;采用心脏整体钙成像技术检测发现心房肌中异常钙波发生频率明显增多。CAPN 1-OE+MDL处理组中,上述钙火花频率增高等异常钙稳态现象明显改善,而在心脏整体灌流钙荧光指示剂染色成像中,结果提示MDL处理可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的钙稳态异常。4.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房电重构同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌AERP大幅缩短,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌AERP这一关键电重构指标明显改善。原位观测小鼠心房肌细胞中T管结果提示,在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而MDL处理组可使CAPN 1-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善。5.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的结构重构CAPN 1-OE 8周组小鼠心房可见显著的双心房腔扩大,且AW/TL显著增大,Masson染色提示心肌纤维化明显增多,WB结果显示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等纤维化相关指标均明显激活;而Calpain抑制剂MDL处理后,CAPN 1-OE小鼠心房扩张、心室肥厚显著改善,WB结果提示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等蛋白表达水平显著下调,Masson染色同样证实了CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌纤维化程度的改善。(三)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.成功建立了Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型在该部分,首先建立了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE)。与对照组小鼠相比,在撤除Dox药物饲料4周,即JP2过表达激活4周时,JP2-OE小鼠的心房肌组织中JP2的蛋白表达水平显著增高;将JP2-OE小鼠与CAPN 1-OE小鼠杂交,即可得到Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.在撤除Dox药物饲料4周时,心脏超声结果提示各组小鼠左室功能未见明显异常超声心动图结果显示,对照组小鼠,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等3组小鼠,其左室射血分数LVEF,收缩末左室容积ESV,以及舒张末左室容积EDV等未见显著差别;取小鼠心脏、肺脏等称重后,各组小鼠心脏重量/体重HW/BW、肺脏重量/体重LW/BW的变化情况等未见显著差别。3.在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠均出现较明显的左室功能受损超声心动图结果显示,同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等,其LVEF显著下降,而ESV及EDV等指标显著升高,提示存在明显的左心收缩舒张功能障碍;此外,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等HW/BW显著增大,但LW/BW未见显著差别,提示存在显著的心脏肥厚,但未见明显的肺脏淤血等。4.三组小鼠窦房结传导功能均未见明显异常在撤除Dox药物饲料4周时,检测三组小鼠心房标准窦房结恢复时程cSNRT后发现,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标均未见异常,提示CAPN 1-OE和/或JP2-OE并未对小鼠窦房结功能产生影响。在撤除Dox药物饲料8周时,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标变化均未达到统计学差异,提示窦房结功能仍维持正常水平。5.三组小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性的变化情况JP2过表达4周,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性均显著上升;JP2过表达8周时,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌Calpain-1酶活性呈进一步升高。提示JP2-OE并不能改变Calpain-1酶活性。6.在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显著降低CAPN 1-OE小鼠房颤的诱发率和持续时间同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后可诱发出房颤的比例显著增高,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率明显降低,且房颤事件发作持续时间也明显缩短。7.在撤除Dox药物饲料8周时,JP2-OE未能改善CAPN 1-OE小鼠明显升高的房颤诱发率CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后房颤诱发率显著增高,而JP2-OE并未使能显著改善CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率,但仍可明显缩短房颤事件的发作持续时间。8.三组小鼠心房肌JP2蛋白表达水平变化情况在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显著改善CAPN 1-OE小鼠心房肌组织内的JP2蛋白表达水平;但在撤除Dox药物饲料8周时则无法维持心房肌JP2正常水平,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中的JP2蛋白含量也显著下降。提示JP2表达水平逐渐下降,是导致CAPN 1-OE小鼠房颤易感性增加的机制之一,而维持正常水平的JP2蛋白水平,是JP2-OE发挥调节房颤易感性的蛋白基础。9.JP2过表达4周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中钙火花发生频率明显改善。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌中自发性钙波等异常钙释放事件显著增多,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌中钙波发生频率明显改善,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。10.JP2过表达8周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同心房肌钙波发生频率异常增多的CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌自发性钙波发生频率未见明显减少,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。11.JP2过表达4周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠经食管程序性S1S2电刺激后可发现其AERP显著缩短,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的AERP得以明显改善;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,在撤除Dox药物饲料4周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而对照组小鼠心房肌细胞内可见规律存在的T管,且广泛分布于大部分心房肌细胞中,JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善,完整、规律排列的T管系统有助于细胞电信号的精细传递。12.JP2过表达8周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠经S1S2食管电刺激后发现AERP均显著缩短;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,JP2过表达8周时,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房T管系统的完整性未见明显改善,提示此时JP2过表达未能有效改善房颤小鼠的电重构。13.JP2过表达4周对房颤小鼠心房结构重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房重量/胫骨长度AW/TL明显增大,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠AW/TL明显改善,而大体心脏标本也可得出同一结论,肉眼可见CAPN 1-OE小鼠双心房,尤其是左心房明显扩大,而CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔扩大明显改善;心房肌组织纤维化也是房颤维持的重要基质改变。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均显著增高,WB结果显示CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房肌组织中经典促纤维化信号通路TGF-β1/α-SMA/Col I均明显激活,提示JP2-OE参与调控小鼠心房腔的大小,未能有效改善房颤小鼠心房纤维化信号通路的激活。14.JP2过表达8周对房颤小鼠心房结构重构的影响JP2过表达8周时,同CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔的扩大未得到有效抑制。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均进一步增高。五、研究结论1.在房颤患者及房颤实验模型中,随着心房快速刺激持续存在,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐降低,而Calpain-1表达明显上调且其酶活性显著激活,且心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显著负相关;2.在CAPN 1-OE小鼠房颤模型中,JP2蛋白是Calpain-1重要降解底物之一。在Calpain-1蛋白过表达8周时,MDL28170通过显著抑制Calpain-1酶活性,并改善心房肌蛋白JP2的表达水平,显著改善房颤的易感性;3.心房肌细胞JP2蛋白的变化,可通过调节房颤小鼠心房肌细胞钙稳态(钙火花、钙波等钙异常释放事件),进而影响心房电重构(AERP变化、T管结构重构)及结构重构(心房腔扩大、心房纤维化),从而影响小鼠房颤易感性(房颤的发生率及持续时间);JP2-OE作为潜在的治疗房颤的可能手段,其调控房颤易感性的作用有一定的时程性。
【图文】：

心肌组织,持续性房颤,患者

图 1-1 持续性房颤患者心肌组织中 JP2 蛋白表达水平显著降低Fig 1-1. The expression level of JP2 protein in atrial myocardium decreased significantlinAF patients.

持续性房颤,心肌组织,酶活性,患者

持续性房颤患者心肌组织中 Calpain-1 蛋白表达水平及酶活性显著升高2. The expression level and activity of Calpain-1 in atrial myocardium iy inAF patients. 临床患者心房肌组织中 JP2 蛋白水平与 Calpain-1 蛋白酶活性成显著负3.The atrial JP2expression level was negativelycorelatedwith theactivityofrial samples of patients.
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.75

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