Calpain-1通过内质网应激-自噬反应在房颤发生机制中的作用及研究

发布时间：2020-05-07 10:43

【摘要】：心房颤动(Atrial fibrillation,AF)简称AF,是临床上最常见的房性心律失常,AF的并发症以及病死率近年来逐年增高,为临床AF治疗带来一定的挑战。AF的具体发生病理生理机制仍未明确。肺静脉的局灶激动对于AF的发生至关重要,但是在AF维持阶段,心房的结构重构以及电生理重构也起到至关重要的作用,在持续性AF的研究中发现,心肌细胞中Ca~(2+)的释放异常被认为是最核心的一环。而大量研究证实,细胞自噬(Autophagy)在心肌损伤中扮演着重要的角色,它是一种由氧化应激、损伤、缺血等诱发的非凋亡性、程序性细胞死亡方式。目前研究认为,自噬是细胞纤维化的初始状态,而且大量动物研究亦证实AF细胞中存在着自噬性细胞死亡。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的自噬已在多种疾病和病理过程中被观察到。ERS反应主要通过IRE1/JNK通路可以促进细胞自噬的发生,已被证实可以直接影响自噬关键蛋白Beclin-1以及Bcl-2的磷酸化,促进细胞自噬的发生,而ERS亦可以通过MAPKs(mitogen-activated protein kinases)通路促发心肌细胞自噬,进一步引起心房肌纤维化,在AF发生机制中发挥重要作用。钙蛋白酶-1(Calpain-1)Calpain-1可通过调控钙离子稳态而在AF发生中起至关重要的作用。ERS与AF密切相关,ERS-自噬反应可促进心房肌细胞纤维化的发生,而心房肌纤维化是AF发生的重要病理性结构重构,进而在AF发生机制中起到重要作用。Calpain-1在ERS的发生机制中起到重要的调节作用,因此,Calpain-1与ERS的相互作用是否是引起AF发生的重要机制之一呢?这是一个值得深入研究的问题。本课题将在业已建立的快速起搏心房兔AF模型上,从整体、细胞及超微结构水平,深入探讨Calpain-1对ERS-自噬表达水平变化的影响,并重点研究其对肌浆网钙离子荧光强度事件以及延迟后除极(delayed after depolarization,DAD)等异常电触发活动的调控机制,明确Calpain-1与ERS-自噬的相互作用在AF发生机制中的作用及意义,有助于揭示AF发生及发展的可能电重构以及结构重构机制,为AF治疗靶向药物的研发,提供新的思路和理论依据。第一部分AF患者心房肌Calpain-1及ERS-自噬相关基因表达的研究一、研究目的通过临床AF患者以及窦律患者心房肌组织标本的研究明确Calpain-1、ERS-自噬相关基因在AF发生中作用以及与AF发生的相关关系。二、研究方法选取2015年1月至2016年12月在海军军医大学附属长征医院心脏外科住院的合并AF并因二尖瓣病变拟行二尖瓣置换或成形手术的手术患者,获得心房肌组织标本,采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印迹以及QT-PCR等方法,检测Calpain-1蛋白与mRNA表达以及酶活性的变化,并对ERS以及自噬相关蛋白与mRNA进行检测,明确在AF发生中作用与关系。三、结果1、两组患者在性别、年龄以及其他实验室方面无明显差异,在主动脉阻断时间、体外循环时间等手术相关资料方面亦无明显差异;2、AF患者心房肌组织中细胞数目较SR组明显减少,排列稍紊乱,结缔组织增生明显,偶可见肌细胞溶解;3、相比于SR组心房肌细胞,AF组心房肌细胞Calpain-1的蛋白以及酶活性表达相对值明显升高;4、AF组心房肌细胞ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达量与mRNA相比于SR组显著升高;5、AF组患者心房肌细胞自噬相关特异性蛋白LC3B-II与Beclin-1含量均较SR组心房肌细胞明显增高。四、结论1、AF患者心房肌细胞中Calpain-1的蛋白表达明显增高,且Calpain-1酶活性亦显著高于SR患者;2、AF的患者心房肌细胞中ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达以及mRNA含量明显高于SR患者心房肌细胞;3、AF的患者心房肌细胞中自噬相关蛋白LC3B-II以及Beclin-I的表达以及mRNA含量明显高于SR患者心房肌细胞。第二部分Calpain-1对ERS-自噬相关基因表达影响的实验研究一、研究目的明确Calpain-1在AF动物模型心房组织中mRNA及蛋白表达变化的规律以及Calpain-1在AF动物模型中对ERS-自噬反应关键蛋白的影响变化。二、研究方法采用遥测心电快速起搏方法建立的新西兰大白兔AF模型,并通过Calpain-1特异性抑制剂进行干预实验,将实验动物分成Sham组,AF组以及AF+MD28170三组。在实验处理后去兔心房肌细胞进行实验室检测。采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印迹、QT-PCR、电子透射电镜以及免疫荧光共聚焦等方法,对各组实验动物心房肌细胞检测Calpain-1蛋白与mRNA表达以及酶活性的变化、ERS以及自噬相关蛋白与mRNA表达情况、心房肌细胞自噬形态学变化以及钙离子荧光强度事件进行检测,明确Calpain-1在AF中对ERS-自噬反应关键蛋白的影响变化。三、结果1、各组AF自发持续率有显著差异,但AF与AF+MDL28170组AF两组比较无显著差异,各组AF持续时间无显著差异;2、AF组心肌细胞间质可见蓝染的胶原纤维明显增多,胶原纤维增生加重,胶原纤维相互交织,AF+MDL28170组心肌细胞较AF组细胞间质胶原纤维含量较AF组明显减少,心肌排列稍有序;3、AF组Calpain-Ⅰ蛋白以及酶活性表达明显上调,但相比于AF组与Sham组,AF+MDL28170组Calpain-Ⅰ蛋白以及酶活性表达显著降低;4、AF组较AF+MDL28170组GRP78以及CHOP蛋白以及mRNA表达显著升高,但p-PERK以及ATF6表达差异不显著;5、AF组以及AF+MDL28170组自噬相关特异性蛋白LC3B-II与Beclin-1表达均较Sham组心房肌细胞明显增高;6、AF组心房肌细胞的自噬小体以及LC3B-II荧光点显著增多,AF+MDL28170组自噬小体与LC3B-II荧光点相比AF组显著减少,但仍较Sham组增多;7、与AF组相比,AF+MDL28170组胞质中钙离子荧光强度较稍有减弱,但仍较Sham组明显增强。四、结论1、在快速起搏兔AF模型中,AF组以及Calpain-1抑制剂组中ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP的表达以及mRNA含量表达较正常组显著增加;2、AF组动物模型心肌细胞中CHOP的表达以及mRNA含量明显高于Calpain-1抑制剂组;3、AF的心房肌细胞中自噬相关蛋白LC3B-II以及自噬流表达显著增高。第三部分Calpain-1通过ERS-自噬反应在AF发生机制中作用的研究一、研究目的明确Calpain-1通过ERS-自噬通路表达变化在AF动物模型中的表达变化以及对AF发生可能的机制作用。二、研究方法在第二部分基础上,仍采用遥测心电快速起搏方法建立的新西兰大白兔AF模型,并通过ERS激活剂、抑制剂以及Calpai-I特异性抑制剂进行干预实验将实验动物分成6组。同样采用HE、MASSON染色、蛋白免疫印迹、QT-PCR、电子透射电镜以及免疫荧光共聚焦等方法,对各组实验动物心房肌细胞Calpain-1酶活性的变化、ERS以及自噬相关蛋白与mRNA表达情况、心房肌细胞自噬形态学变化以及钙离子荧光强度事件进行检测,明确Calpain-1在AF中通过ERS对心房肌细胞自噬以及钙离子荧光强度的影响。三、结果1、AF,AF+MT心肌细胞间质可见蓝染的胶原纤维明显增多,胶原纤维增生加重,心肌排列紊乱,可见稍许细胞核裂解;2、AF、AF+4PBA以及AF+MT组Calpain-Ⅰ蛋白及酶活性明显增加,此外,Sham组Calpain-Ⅰ蛋白但相比于AF+MDL28170+4PBA以及AF+MDL28170+MT组表达增高;3、AF+MT组ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及CHOP含量表达最显著,AF与AF+MDL28170+MT组ERS相关蛋白表达低于AF+MT组,但高于Sham、AF+4-PBA以及AF+MDL28170+4-PBA组;4、AF组以及AF+MDL28170组自噬相关特异性蛋白LC3B-II与Beclin-1表达均较Sham组心房肌细胞明显增高,与AF组相比,AF+MT组自噬相关蛋白显著增高,但与AF+MDL28170+MT组无显著差异;5、AF组以及AF+MT组相比于Sham组自噬小体以及LC3B-II荧光点相比其他组显著增多,而以AF+MT组更明显;AF+MDL28170+MT组心房肌细胞中自噬小体以及LC3B-II荧光点与AF组无显著差异;6、AF+MT组胞质中钙离子荧光强度显著增高,AF与AF+MDL28170+MT组钙离子荧光强度明显低于AF+MT组,但高于Sham、AF+4-PBA以及AF+MDL28170+4-PBA组。四、结论1、在快速起搏兔AF模型中,ERS激活剂可显著增加心房肌细胞自噬相关蛋白Benlin-1以及LC3II-B的表达以及mRNA含量表达;2、Calpain-1在AF动物模型心房肌细胞中激活心房肌细胞自噬增加的程度可被ERS抑制剂降低;3、Calpain-1抑制剂联合ERS抑制剂可显著降低AF心房肌细胞自噬的程度和发生。综上所述,Calpain-1可能通过ERS中CHOP信号通路进一步激活心房肌细胞的自噬水平,从而在AF发生机制中扮演重要角色。
【图文】：

图 1-1 患者筛选流程图断标准及心电图（ECG）为主要检查标准，ECG 标准不等或者间隔心房电活动间期时限＜200ms。定义按照 2017 年 AHA/ACC/HRS 房颤管理指南及方法仪器及设备机 丹麦Labogene公司机 丹麦Labogene公司盐城航星公司CANNON公司（日本

图 1-2 AF 及窦律患者心房肌组织 HE 与 MASSON 染色（×200 倍）图 A：SR 组心房组织 心房肌细胞总体排列整齐，紧密有致，肌纤维连续性好，心肌细胞核大小有致。图 B：AF 组心房组织 心肌细胞排列亦紊乱，细胞数目较 SR 组减少，部分区域可见肌细胞溶解，且心肌间质可见部分不规则结缔组织增生。图 C：SR 组心房组织心肌细胞排列有序，心肌间纤维分布稀疏，粗细交织呈条状排列，胶原纤维含量较少。图 D：AF 组心房组织 心肌组织排列杂乱，蓝染的纤维束分布于心肌组织之间，部分缺乏正常的结构，细胞间隙可见大量蓝染的胶原纤维，相互交织，粗细不等。（二）心肌组织 Calpain-1 蛋白表达以及酶活性检测结果我们通过 WB 方法检测了 SR 以及 AF 患者心房肌细胞中 Calpain-1 的蛋白表达含量 1-3），通过计算各条带灰度值并进行统计分析（图 1-4）。AF 组 Calpain-Ⅰ蛋白表显上调，相比于 SR 组显著升高，，差异有统计学差异（1.454±0.124 vs 0.965±0.2130.001）。此外，通过 Calpain-1 酶活性试剂盒检测，AF 组患者心房肌细胞 Calpain-性显著高于 SR 组（图 1-5）（2.236±0.064 vs 0.985±0.011，P＜0.001）。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.75

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本文编号：2652855