【摘要】：前言:硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin Reductase,TrxR)是吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员之一,该酶是含黄素腺嘌呤二核苷酸结构域的二聚体硒酶。TrxR与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)和还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)共同构成了硫氧还蛋白系统,通过维持Trx还原性在氧化还原调节和抗氧化防御中发挥重要作用。此外,TrxR还参与调节炎症转录因子激活、细胞增殖、凋亡抑制和胚胎发育等。在已分离鉴定的哺乳动物TrxR家族成员中,TrxR1主要存在于细胞浆中,表达最广泛,作用最突出。本课题组前期应用RT~2Profiler?PCR Array System筛查了高血压和正常对照个体血液样本84个氧化应激及抗氧化相关基因,结果显示TrxR1的编码基因TRXR1在病例-对照组间表达差异显著,提示TrxR1可能在高血压发生和进展中发挥重要作用。目前关于TRXR1的表达调控研究多集中于转录水平,如位于启动子区的Oct-1,Sp1和Sp3等转录因子结合元件参与调节该基因转录。此外,有学者发现TRXR1的3′-非翻译区存在一个富含AU的元件和一个硒代半胱氨酸插入元件,且两者均可能影响mRNA稳定性,提示转录后水平可能也在TRXR1基因表达调控中发挥重要作用。近年来,微小RNA(microRNA,miRNA)作为转录后水平重要调节因子,其靶基因及其生物学效应被广泛鉴定和研究。迄今为止,未见有关TRXR1基因miRNA研究报道,病理条件下TRXR1表达异常是否由于miRNA途径介导亦尚不清楚。因此,本研究拟通过生物信息学预测、报告基因实验、real-time PCR和Western blot等方法探索miRNA调节TRXR1及其在高血压氧化应激中的作用。材料与方法:实验材料1.细胞系HEK293、HUVEC及细胞培养相关试剂2.基因克隆及荧光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂3.Real-time PCR、RT-PCR及Western blot相关试剂4.总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和TrxR活性检测相关试剂和试剂盒5.过氧化氢(H_2O_2)、放线菌素D(转录抑制剂Actinomycin D)、Tempol(活性氧清除剂)和miR-125a inhibitor6.高血压及正常对照个体外周血标本共41例实验方法1.应用生物信息学软件对TRXR1基因3′-UTR进行miRNA靶向预测以及序列保守性比对分析;2.基因重组技术构建miR-125a表达载体及TRXR1 3′-UTR萤光素酶报告载体。应用Dual-Glo~(TM)双荧光素酶检测系统检测miR-125a过表达或抑制对pGL3-UTR的报告基因活性的影响;构建序列截短的miR-125a启动子(-980~+34)荧光素酶报告载体,转染HEK293细胞,双荧光素酶检测系统检测H_2O_2及Tempol刺激前后miR-125a基因启动子活性变化;3.real-time PCR及Western blot实验检测miR-125a过表达或抑制对内源性TRXR1 mRNA和蛋白质表达的影响;real-time PCR和Western blot实验检测不同浓度和时间H_2O_2刺激细胞TRXR1 mRNA和蛋白质表达变化;Real-time PCR检测H_2O_2诱导下的细胞中miR-125a表达水平;RT-PCR检测miR-125a初级转录本的表达水平;转染miR-125a表达载体,应用H_2O_2刺激细胞,检测过表达miR-125a后TRXR1表达变化;4.试剂盒检测收集样本的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、TrxR活性。结果:1、应用Pictar和TargetScan软件在TRXR13′-UTR预测到1个miR-125a的结合位点;UCSC Genome Bioinformatic对多个哺乳动物的TRXR1序列比较,发现TRXR1 3′-UTR与miR-125a“种子序列”互补的靶序列在人、小鼠、大鼠、牛和狗具有高度保守性。2、HEK293细胞中过表达miR-125a后TRXR13′-UTR野生型报告载体荧光素酶活性明显下降,miR-125a抑制剂可使其活性上升;而对miR-125a互补区突变后的突变型载体给予同样的处理,报告基因活性无明显变化。3、Real-time PCR结果显示,转染pmiR-125a后,细胞内源性TRXR1 mRNA水平没有明显改变;而Western Blot检测发现TrxR1蛋白水平明显下降,该效应可被特异性miR-125a inhibitor抑制。4、H_2O_2刺激使细胞中TRXR1 mRNA及蛋白质表达增多;应用转录抑制剂放线菌素D预处理后,抑制了H_2O_2诱导的TRXR1 mRNA升高,而蛋白质表达水平仍有一定升高。5、Real-time PCR显示H_2O_2刺激后miR-125a表达水平明显下降,RT-PCR结果显示miR-125a初级转录本的表达明显下降,而活性氧清除剂Tempol预处理可抑制H_2O_2的作用。6、过表达miR-125a可抑制H_2O_2诱导的TrxR1蛋白表达,进一步表明H_2O_2诱导的TrxR1表达部分通过降低miR-125a实现。7、荧光素酶检测结果显示,miR-125a基因启动子(-980~+34)载体中p924-luc报告基因活性最强;H_2O_2抑制miR-125a基因启动子活性。8、高血压组T-AOC较正常对照增高,血清TrxR活性较正常对照组高,血清miR-125a表达水平较正常对照组低,且miR-125a表达水平与TrxR活性呈负相关趋势(r=-0.511)。结论:1、miR-125a通过与TRXR1 3′-UTR特异序列靶向结合,在转录后水平抑制该基因的表达。2、miR-125a参与了H_2O_2诱导的TrxR1表达;H_2O_2通过抑制miR-125a启动子活性降低其表达。3、在本研究高血压病例-对照人群样本中,血清miR-125a水平与TrxR活性呈负相关趋势。
【图文】：
图 1-1 生物信息学分析预测 TRXR1 3′-UTR 潜在结合的 miRNA 及 TRXR1 3′-UTR 序列在多种哺乳动物间的保守性A. Pictar 及 TargetScan 在线软件预测人 TRXR1 3′-UTR 结合 miRNA 的部分结果；B. miR-125a 与 TRXR1 3′-UTR 互补结合示意图；
18图 1-2 pmiR-125a 载体构建及其表达鉴定A．pmiR-125a 表达载体示意图及 pmiR-125a 载体测序峰图，下划线标示处为 miR-125a 前体序列，，长度为 86bp；B. Real-time PCR 检测 pmiR-125a 在 HEK293 细胞中过表达； C. Western blo
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1
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