【摘要】：背景:临床病人在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)期间出现高血糖(hyperglycemia,HG)的情况越来越常见,目前关于HG是否加重MI损伤的程度是有争议的。大多数研究认为,无论入院前是否患有糖尿病(diabetes mellitus,DM),AMI患者出现HG与死亡率增加或预后更差相关;但也有研究报道,HG在某些条件下对心肌缺血引起的心肌损伤具有保护作用。TNNI3K(troponin I interacting kinase)是新发现的MAPKKK家族的一种激酶,在心脏内特异性表达,并与心肌肌钙蛋白I特异性的结合。研究表明TNNI3K能促进心肌生成,增强心脏功能,并通过抑制p38/JNK介导的细胞凋亡来保护心肌免受缺血性损伤。TNNI3K也与心脏缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤有关。在治疗缺血性心脏疾病的药物研究中,目前已经有针对TNNI3K作为标靶药物的报道;但在缺血性心脏病合并HG的临床病例或疾病模型中,尚无任何涉及TNNI3K的研究报道。目的:1.研究小鼠MI/R损伤后梗死周围区的心肌表达TNNI3K与SCF或者SDF-1之间的联系;2.研究HG对小鼠MI/R损伤后梗死周围区的心肌表达TNNI3K、SCF和SDF-1的影响及其可能的相关机制。方法:体内实验:1.用正常成年C57小鼠构建MI/R损伤模型,分别设置sham(假手术)组、MI/R损伤后的第3、5和7天组。造模术中血管显微镜下直视,并用HE染色和Evans blue+TTC双染色鉴定MI/R造模是否成功。用多种方法检测各组的梗死周围区的心肌组织表达TNNI3K、SCF和SDF-1的变化趋势,并选取其中一个合适时间作为后续与HG组对照的MI/R时间点。2.用STZ诱导C57小鼠HG模型,然后分别制作正常糖(NG)和高血糖(HG)组小鼠的MI/R损伤模型,取MI/R损伤后第5天的心脏,用免疫组织化学方法检测各组梗死周围区心肌组织内TNNI3K、SCF和SDF-1蛋白的表达及定位。用ELISA检测各组心肌组织表达SCF和SDF-1分泌型蛋白的情况;用Western blot检测各组心肌组织内TNNI3K、SCF和SDF-1总蛋白的表达以及AKT和p38的磷酸化情况,并观察三者之间的联系;用RT-qPCR检测各组心肌组织内TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA水平的表达。体外实验:分离培养C57乳鼠的原代心肌细胞24-48h,待细胞状态较好(活性好和数量足够)时,先换不同糖浓度(5.5、25和33mmol/L)和相应的高渗对照组的培养基,常氧培养12h后,再行缺氧复氧(A/R)处理。用Western blot检测各组心肌细胞内TNNI3K、SCF和SDF-1总蛋白以及AKT和p38的磷酸化的表达情况,并选取其中一个合适的高糖浓度作为后续实验的HG组;ELISA检测各组心肌细胞内SCF和SDF-1分泌蛋白的表达,RT-qPCR检测各组心肌细胞内TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA的表达情况。结果:1.STZ诱导的HG组小鼠的血糖浓度达到23.66±0.81mmol/L,而control组的血糖值为6.81±0.15mmol/L,两组间有显著性差异(P0.05,n60)。2.HE染色和Evans blue+TTC双染色显示按照本实验方法制作出的小鼠MI/R模型可靠。3.在NG组中,与sham组相比,MI/R组的梗死周围区心肌组织表达TNNI3K、SCF和SDF-1蛋白和mRNA主要在第5天均明显升高(P0.05,n10);NG和HG的sham组梗死周围区表达三者的蛋白和mRNA的差别均不明显(P0.05,n10);NG和HG的MI/R组梗死周围区心肌组织表达TNNI3K、SCF和SDF-1三者的蛋白和mRNA均较各自的sham组明显升高(P0.05,n10),而HG的MI/R组三者的蛋白和mRNA表达均低于NG组(P0.05,n10)。4.HG组(糖浓度33mmol/L)的心肌细胞内TNNI3K、SCF和SDF-1 mRNA和蛋白的表达比LG组和相应的高渗对照组均明显降低(P0.05,n10)。5.Western blot检测显示:HG的MI/R组心肌组织内表达P-AKT/AKT和P-p38/p38比NG的MI/R组均明显降低(P0.05,n10);同时HG组(糖浓度33mmol/L)的心肌细胞内表达P-AKT/AKT和P-p38/p38比LG组和相应的高渗对照组均明显降低(P0.05,n10)。结论:1.在NG组MI/R损伤模型中,梗死周围区心肌组织内TNNI3K的表达与SCF和SDF-1的表达同步升高,且三者的表达主要在MI/R损伤后的第5天明显升高。2.HG减弱了MI/R损伤后心肌组织内和A/R处理后的心肌细胞内TNNI3K、SCF和SDF-1表达水平的升高,这可能是通过抑制AKT和p38 MAPK通路的磷酸化来实现。
【图文】：
图 1 实验小鼠的血糖浓度2、鉴定小鼠 MI/R 模型分别取各组梗死周围区的心脏组织，Hsham 组相比，NG 和 HG 的 MI/R 损伤后第面积约 40%左右，，说明本实验模型成功。EEvans blue 蓝染区是非梗死区的心肌组织；TTTC 染色阴性的苍白区是完全梗死无活性验方法可以成功构建小鼠的 MI/R 损伤模型150 例以上，成功率达 75%。
图 2 A、 HE staining B、 Evans blue+ TTC 双染色A、各组梗死区及其周围区心肌组织的 HE 染色结果，图中箭头所指即为梗死区。B、Evans blue+ TTC 双染色结果，蓝染区是非梗死区的心肌组织；红染区是有活性的梗死区心肌组织，苍白区是完全梗死无活性的心肌组织（即真正的梗死区）。3. 免疫组化检测 TNNI3K、SCF 和 SDF-1 在 MI/R 损伤后的心肌组织内的表达及定位免疫组织化学法检测 NG 和 HG 的小鼠 sham 组和 MI/R 损伤术后第 5天组的梗死区和梗死周围区的心肌组织，100×镜下可见结果如图 3 所示：NG 和 HG 的 MI/R组梗周的心肌组织表达 TNNI3K、SCF 和 SDF-1 三者的蛋白均较各自的 sham 组明显升高，而梗死区几乎都不表达，但 HG比 NG 的 sham组和 MI/R 组梗死周围区的心肌组织表达 TNNI3K、SCF和 SDF-1蛋白均明显降低。另外 400×镜下可见：TNNI3K
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22
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本文编号：2661001
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