ALK7在AGEs诱导血管外膜成纤维细胞活化中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-13 04:30

【摘要】：糖尿病动脉硬化是多种心脑血管疾病——冠心病、脑卒中以及周围血管疾病的共同病理基础。血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts,AFs)是血管外膜最丰富的细胞类型,糖尿病状态下,其发生表型改变和增殖、迁移能力增强,胶原分泌增加,是导致动脉硬化主要病理机制之一。AGEs是蛋白质、脂蛋白或者核酸等大分子在非酶催化、自发的与葡萄糖或其他还原性单糖反应所形成的稳定的共价生成产物,是糖尿病并发症发生发展的重要中间物质。研究发现,长期慢性高糖状态下,AGEs生成增加,通过多种途径促进糖尿病心血管疾病的发生发展。活化素受体样激酶-7(Activin receptor-like kinase 7,ALK7)是从人胎盘克隆出的Activin受体家族新成员,也是TGF-β超家族I型受体之一,近年研究发现其通过多种途径参与糖尿病的发生发展。研究发现,糖尿病大鼠ALK7下调后,动脉纤维化程度得到明显改善,并且ALK7与糖尿病的发生发展以及糖尿病心室重构,与糖尿病心肌纤维化关系密切。因此,本研究提出以下假说:糖尿病状态下,AGEs通过ALK7信号通路调节AFs的增殖、迁移、胶原分泌,引起血管外膜胶原沉积,管壁结构发生改变,最终导致动脉硬化。目的:1.观察AGEs对血管外膜成纤维细胞活化的影响;2.探讨ALK7在AGEs诱导血管外膜成纤维细胞活化中的作用及可能机制;方法:1.体外培养SD大鼠血管外膜成纤维细胞,给与AGEs刺激,同时设置对照组,检测血管外膜成纤维细胞的增殖活力、迁移能力、表型转换及I型、III型胶原蛋白表达水平;2.AGEs刺激血管外膜成纤维细胞,同时设置对照组及BSA组,观察ALK7蛋白的表达水平;3.构建ALK7 siRNA质粒,感染血管外膜成纤维细胞以抑制其ALK7的表达,给与AGEs刺激后,观察细胞增殖活力、表型转换及I型、III型胶原蛋白表达水平的变化。结果:1.血管外膜成纤维细胞原代形态学观察及免疫学鉴定结果;细胞呈扁平梭型,细胞核较大,约1-2个,细胞质透明;免疫标记物鉴定vimentin绿色荧光阳性,α-SMA红色荧光为阴性,证实为血管外膜成纤维细胞。2.AGEs促进AFs细胞增殖、表型转换及Collagen I/III的分泌;AGEs刺激血管外膜成纤维细胞48h,与对照组比较,细胞增殖活力增加(P0.05),BSA组与对照组比较无明显差异;AGEs刺激血管外膜成纤维细胞48h,与对照组比较,α-SMA表达增加(P0.05),BSA组与对照组比较无明显差异;与对照组相比,Collagen I/III分泌增加(P0.05),BSA组与对照组比较无明显差异。3.AGEs可以促进ALK7的表达;Western blotting结果证实ALK7在原代大鼠血管外膜成纤维细胞中表达。分别以低糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基+BSA和低糖DMEM培养基+AGEs孵育血管外膜成纤维细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h,结果显示,AGEs刺激8h~48h,ALK7的表达水平较CON组显著增加(P0.05),且成时间依赖性,48h稍下降,但增加差异仍有统计学意义,BSA组与CON组相比较无明显差异。4.ALK7参与调控AGEs诱导的AFs细胞增殖迁移、表型转换、Collagen I/III分泌增加;采用ALK-siRNA抑制血管外膜成纤维细胞ALK7的表达后,AGEs刺激成纤维细胞48h后,与AGE组相比较,成纤维细胞增殖能力下降(P0.05),划痕实验显示下调ALK7后,与AGE组相比,血管外膜成纤维细胞迁移能力明显降低(P0.05);α-SMA表达水平明显下降(P0.01),I/III型胶原表达水平明显减少(P0.05)。结论:1.AGEs可促进血管外膜成纤维细胞的增殖迁移、表型转换及Collagen I/III的表达;2.AGEs可促进血管外膜成纤维细胞ALK7蛋白的表达;3.ALK7参与调控AGEs诱导的AFs细胞增殖迁移、表型转换以及Collagen I/III的表达增加;
【图文】：

细胞增殖活力的影响EM，CON 组)、牛血清白蛋白组（低糖 DMEM化终末产物组（低糖 DMEM+AGEs 200ug/ml，胞 48h，经 CCK-8 方法检测结果为：糖基化终末和牛血清白蛋白组，晚期糖基化终末产物组增统计学意义（P<0.05）。胞的鉴定（400×）。A，相差显微镜下血管外膜成纤成纤维细胞的免疫学特征。蓝色：细胞核（DAPI）；

结果结果1. 血管外膜成纤维细胞的鉴定倒置相差显微镜下观察细胞（图 1A），，细胞呈扁平梭型，细胞核较大，1-2 个，细胞质透明；细胞免疫荧光染色后可观察到（图 1B）：Vimentin（绿色荧光）为阳性，α-SMA（红色荧光）为阴性，DAPI 标记细胞核呈蓝色，以上细胞形态学及细胞免疫学特征证实该细胞为血管外膜成纤维细胞。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R543.5

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本文编号：2661392