人诱导型多能干细胞来源的间充质干细胞功能表征、稳定基因标记及针对缺血环境的体外调控研究

发布时间：2020-05-14 14:52

【摘要】：目的间充质干细胞(MSC)是再生医学研究的重要种子细胞,尽管成年组织有丰富的分布,但成体MSC一般增殖能力有限,且其获取也受到一定的限制。人诱导型多能干细胞(hiPSC)分化来源的MSC(hiMSC)具有很高的自我更新与增殖能力,为成体MSC提供了一种潜在的替代来源。本研究拟首先通过对hiMSC功能进行系统表征,探讨其作为成年MSC的替代来源的可行性;随后,探讨hiPS C稳定转基因标记的体系与方法,为hiMSC移植后的追踪检测奠定基础;最后,针对缺血性损伤微环境,探讨通过纳米颗粒携带miR21调控hiMSC耐受缺血微环境的可行性与有效体系,以建立hiMSC移植前体外修饰改善其治疗潜能的新方法。方法用MSC诱导培养基直接将hiPSC诱导分化为MSC细胞(hiMSC);流式鉴定比较hiMSC以及hBMSC表面标志物CD11b、CD19、CD90、CD73、CD105;显微镜观察比较hiMSC与hBMSC早期代数的形态学性状;CCK8检测比较hi MSC与hBMSC早期增殖能力以及长期增殖能力;实时定量PCR检测比较hiM SC与hBMSC多能性以及比较hiMSC与hBMSC旁分泌功能;为构建稳定基因转染的hiPSC,首先构建双启动子慢病毒颗粒,分别驱动绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)与荧光虫荧光素酶表达(Fluc),比较不同方法浓缩慢病毒的效能,以建立优化的慢病毒制备体系;随后,转染标记hiPSC,在hiPSC长期增殖与分化过程中检测报告基因的表达,确定在hiPSC及其来源细胞中稳定活性的启动子,从而建立hiPSC稳定转基因标记体系;通过超声乳化制备PLGA纳米颗粒并通过琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度计检测优化PLGA纳米颗粒与miR21复合的优化比例;通过CCK8检测评价PLGA纳米载体与hiMSC的生物相容性以优化纳米载体使用剂量;通过荧光染料对PLGA纳米颗粒进行标记,随后与hiMSC进行孵育,不同时间点观察纳米颗粒进入细胞的水平,确定最佳孵育时间;在此基础上,优化PLGA/miR21纳米颗粒调控hiMSC的最佳剂量并探索其有效调控时间,以建立基于PLGA/miR21纳米颗粒体外调控hiMSC的优化体系;以过氧化氢模拟缺血条件下氧化应激微环境,通过细胞活力检测等评价上述调控方法改善hiMSC治疗潜能、增强其耐受氧化应激微环境的有效性。结果hiMSC表面标志物CD105、CD90、CD73阳性表达而CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;hBMSC早期代数细胞呈长梭形而hiMSC早期代数细胞呈短梭形;hBMSC与hiMSC P6代之前细胞增殖能力基本一致,而P6代以后hiMSC细胞增殖能力要强于hBMSC细胞增殖能力;hiMSC和hBMSC都具有成骨、成脂多能性;hBMSC分泌PLGF、HIF-1α、SDF-1、SCF、bFGF生长因子的能力强于hiMSC,而分泌VEGF的能力比hiMSC弱;超滤管法浓缩慢病毒的GFP转染效率最高;GFP成功标记人诱导多能干细胞(hiPSC)并在其诱导分化的间充质干细胞(hiMSC)中稳定表达,但是Fluc未能成功标记人诱导多能干细胞;100ug包被PEI的PLGA纳米颗粒可以将200pmol的miR21全部吸附掉;0ug/ml、20ug/ml、100ug/ml、200ug/mL PEI包被的PLGA纳米颗粒与hiMSC孵育7天,CCK8检测细胞活力基本一致;hiMSC吞噬PLGA纳米颗粒12h后达到最大吞噬量;QRT-PCR检测PEI包被的PLGA纳米颗粒和lipofectmaine RNAiMAX携带的miR21最佳浓度是40nM;PEI包被的PLGA纳米颗粒介导的miR21转染组要比lipofectmaine RNAIMAX介导的miR21转染组在过氧化氢模拟缺血条件下氧化应激微环境的生存能力强。结论成功将hiPSC诱导分化成hiMSC,流式鉴定显示hiMSC与hBMSC都符合间充质干细胞表面标志物的特征;P6代细胞之后hiMSC增殖能力强于hBMSC且两者都具有多能性;hiMSC与hBMSC旁分泌能力有差异,hiMSC可做为hBMSC的良好替代细胞;GFP在hiPSC及其诱导分化的hiMSC中稳定表达;成功验证了在过氧化氢模拟缺血条件下氧化应激微环境中,PEI包被的PLGA纳米颗粒对miR21的调控效果好于lipofectmaine RNAIMAX介导的miR21转染组。
【图文】：

图 1 hiPSC 表面标志物的免疫荧光染色注：hiPSC 表面标志物抗体染色图（左）；hiPSC 核染色图（中间）；hiPSC 两种合图（右)二、hiMSC 的诱导分化

图 2 hiMSC 诱导分化及 hBMSC 培养注：a、b 分别为 MSC 诱导培养基诱导第 0 天和第 5 天光镜照片；c、d、e、f导 P、P1、P2、P3 代光镜照片；g、h、i 分别为 hBMSC P2、P3、P4 代三、hiMSC 细胞表面标志物流式细胞术鉴定
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

【参考文献】

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本文编号：2663517