HIF-1α和PDGF-B在骨髓增生异常综合征中的表达意义及潜在机制研究

发布时间：2020-05-15 12:10

【摘要】：骨髓增生异常综合征(Myelodys0plastic Syndromes,MDS)是一组具有高度危险性向急性髓系白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)转化的髓系克隆性疾病。目前,MDS的发病机制复杂且尚未清楚,有研究表明骨髓的血管新生参与MDS的发病机制,骨髓血管新生成为MDS发病机制研究的一个新热点。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是缺氧条件下参与血管生成的重要调控因子,与VEGF共同参与血管生成。而血小板衍生生长因子-B(Platelet derived growth factor subunit B,PDGF-B)是PDGF家族中一员,也是血管新生的调控因子。有研究表明HIF-1α与PDGF-B的表达具有相关性,并且共同参与侵袭性乳腺癌的血管生成通路。目前,仅有一篇英文文献报道HIF-1α与MDS的发生和预后有一定的相关性,然而PDGF-B在MDS中尚未有研究。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长度短小的非编码单链RNA,它能与其靶向的基因相结合,抑制靶基因的蛋白翻译或降解靶基因的mRNA,从而调控下游靶基因的表达和其生物学功能。本课题组结合前期工作,进一步研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达意义和相关性;并发现miR-93-5p与HIF-1α和PDGF-B有结合位点,进而研究miR-93-5能否靶向结合HIF-1α和PDGF-B在MDS中发挥生物学功能。材料和方法1.收集82例MDS患者、12例MDS转AML患者以及33例(未累及骨髓的淋巴瘤患者)对照患者共127例骨髓组织蜡块,采用免疫组织化学法检测所有骨髓组织蜡块中HIF-1α和PDGF-B的蛋白表达水平,并结合临床参数分析HIF-1α和PDGF-B在MDS以及AML中的表达意义。2.在GEO、ArrayExpress、Pubmed数据库中,通过检索并筛选含有MDS和对照组或含有AML和MDS的基因芯片或文献;接着,对MDS相关基因芯片进行差异基因的分析,并对筛选出来的差异基因并进行通路富集等生物学功能分析。3.提取MDS相关基因芯片中HIF-1α和PDGF-B的表达数据,分析芯片数据中HIF-1α和PDGF-B的表达水平与MDS、AML的关系,并进行连续型变量合并SMD的meta分析和联合诊断SROC的meta分析,进一步分析基因芯片中HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达意义。4.通过对CCLE、GEPIA和THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库的数据提取,获取HIF-1α和PDGF-B在Pan cancer中的表达情况,分析HIF-1α和PDGF-B的表达水平与肿瘤的关系。5.通过MEM数据库分别获取HIF-1α和PDGF-B的相关基因,对两个基因集取交集得到的基因进行通路富集等生物功能分析,进而对HIF-1α和PDGF-B的表达意义进行进一步的探索与验证。6.通过miRWalk数据库分别预测HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,通过筛选与HIF-1α和PDGF-B均靶向结合并且有结合位点的miRNA,并与GSE76775芯片中的MDS与对照组的差异miRNA取交集,找出能靶向结合HIF-1α和PDGF-B的miRNA。7.通过starBase V2.0数据库发掘HIF-1α和PDGF-B与miR-93-5p在其他肿瘤中的相关性;并通过OncomiR、YM500数据库获取miR-93-5p在Pan cancer中的表达情况,进一步探究肿瘤中miR-93-5p与HIF-1α和PDGF-B的关系。8.通过双荧光素酶试验验证miR-93-5p是否在MDS中能靶向结合HIF-1α,验证HIF-1α和PDGF-B能否作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥生物学功能。结果(一)使用免疫组织化学技术研究HIF-1α和PDGF-B在MDS组织中的表达及其意义1.通过免疫组化检测发现,HIF-1α在MDS组骨髓组织中的阳性率(90.24%)高于对照组骨髓组织中的阳性率(72.73%),并具有统计学意义(P0.05),这提示HIF-1α在MDS骨髓组织中表达上调。2.在MDS患者中,HIF-1α(+)患者的白细胞数(均值=3.65×10~9/L)显著多于HIF-1α(-)患者的白细胞数(均值=2.51×10~9/L)(P0.001);而且HIF-1α(+)患者的中性粒细胞(均值=1.92×10~9/L)显著多于HIF-1α(-)患者的中性粒细胞(均值=1.31×10~9/L)(P0.05)。通过对HIF-1α(+)的患者进行生存分析,发现在性别、WHO分型、染色体核型预后、IPSS分级和原始细胞百分比的分组组别中,生存时间有显著差异(P0.05);而且在与MDS不良预后相关的组别(男性组、RAEB1/RAEB2组、染色体预后不良组、IPSS高危组和原始细胞≥5%组)中,其平均生存期较短。3.通过免疫组化检测发现,PDGF-B在MDS组骨髓组织中的阳性率(98.78%)高于对照组骨髓组织中的阳性率(78.79%),并具有统计学意义(P0.001),这表明PDGF-B在MDS骨髓组织中的表达上调。4.通过对PDGF-B(+)的患者进行生存分析,发现在性别、WHO分型、染色体核型预后、IPSS分级和原始细胞百分比的组别中生存时间有显著差异(P0.05),而且在男性组、RAEB1/RAEB2组、染色体预后不良组、IPSS高危组和原始细胞≥5%组中,这些与MDS不良预后相关的组别的平均生存期较短。5.对HIF-1α和PDGF-B的免疫组织化学数据进行相关性分析,发现在MDS骨髓组织中HIF-1α和PDGF-B的表达水平呈正相关(r=0.19,P0.05)。(二)使用计算生物学研究HIF-1α和PDGF-B在MDS中的表达和意义1.从14个与MDS相关的基因芯片中获得310个差异基因,这些差异基因主要参与B细胞活化、B细胞受体信号通路、造血细胞谱系、TGF-β信号通路和EGF受体信号传导途径等,通过PPI(Protein-protein interaction)分析发现CD19、TLR4、IRF4、CXCR4、APAF1等是整个PPI的核心节点。2.HIF-1α在GSE2779、GSE18366、GSE41130和GSE61853芯片中,MDS组的平均表达水平高于对照组;尤其是在GSE18366芯片中,MDS组的HIF-1α的水平显著高于对照组的水平(P0.05),且在ROC诊断试验中有显著统计学意义(AUC=0.77,P0.05)。PDGF-B在GSE4619、GSE18366、GSE30195、GSE30201、GSE41130、GSE43399、GSE51757、GSE58831、GSE81173和GSE15061芯片中,MDS组的平均表达水平高于对照组;在GSE30201和GSE81173芯片中,MDS组的PDGF-B的水平显著高于对照组的水平(P0.01),且在ROC诊断试验中有显著统计学意义(AUC=0.80,P0.05和AUC=0.83,P0.05);表明PDGF-B不仅在MDS基因芯片中表达上调,且对MDS具有一定的诊断意义。3.PDGF-B在MDS组和对照组的14个芯片数据中,用固定效应模型进行meta分析,SMD=0.27(0.09,0.44),z值为2.60,P值为0.009,表达差异有统计学意义,PDGF-B在MDS基因芯片中表达上调;PDGF-B的合并敏感度为0.63(0.48-0.76),合并特异度为0.74(0.57-0.86),SROC曲线下面积为0.74(0.70-0.78)。PDGF-B对MDS有中等诊断价值。4.HIF-1α在GSE15061(p0.05)中,AML组表达水平高于MDS组;而在GSE25300(p0.05)、GSE51082和GSE61804(p0.05)中,AML组表达水平低于MDS组。PDGF-B在GSE51082(p0.001)和GSE15061中,AML组表达水平高于MDS组;而在GSE25300和GSE61804(p0.01)中,AML组表达水平低于MDS组。5.HIF-1α在AML组和MDS组的4个芯片数据中,用随机效应模型进行meta分析,SMD检测的z值为1.11,P值为0.266,异质性检验I~2=83.7%,P0.001,菱形与无效线相交,表达差异无统计学意义;HIF-1α的合并敏感度为0.59(0.49-0.69),合并特异度为0.90(0.77-0.96),SROC曲线下面积为0.78(0.74-0.82)。PDGF-B在AML组和MDS组的4个芯片数据中,用固定效应模型进行meta分析,SMD检测的z值为0.10,P值为0.922,异质性检验I~2=85.9%,P0.001,菱形与无效线相交,表达差异无统计学意义;PDGF-B的合并敏感度为0.63(0.48-0.76),合并特异度为0.74(0.57-0.86),SROC曲线下面积为0.74(0.70-0.78)。6.在GEPIA数据库30种肿瘤数据中,HIF-1α在24种肿瘤中的表达上调,尤其是在食管癌、颈部鳞状细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、肺鳞状细胞癌、低级别脑胶质瘤、急性骨髓性白血病和胃腺癌中显著上调。而PDGF-B在肿瘤中表达有差异,在15种肿瘤组织的表达上调,特别是淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、胸腺瘤中中显著上调。7.在MEM数据库中获取到HIF-1α和PDGF-B均有相关的605个基因,进行通路分析发现它们主要参与癌症途径、TNF信号通路、B细胞受体信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、病毒癌变、MAPK信号传导途径、胰腺癌等。通过PPI分析发现JUN、UBC、VEGFA、RELA、CALM1等蛋白是整个PPI的核心节点。(三)HIF-1α和PDGF-B在MDS中作为MiR-93-5p靶基因发挥生物学功能1.通过选择miRWalk数据库中的四个预测靶基因的平台分别预测HIF-1α和PDGF-B的靶向miRNA,取两个基因均大于或等于4个平台都共有的miRNA与GSE76775芯片中的MDS与对照组的差异miRNA交集,发现有且仅有mir-93-5p能同时靶向结合HIF-1α和PDGF-B基因。2.利用starBase V2.0数据库,在Pan-cancer project中发现,HIF-1α和PDGF-B与miR-93-5p在多种肿瘤中呈负相关性。MiR-93-5p与HIF-1α在尿路上皮膀胱癌、结直肠腺癌、透明细胞肾癌、急性粒细胞白血病和乳头状甲状腺癌呈负相关。PDGF-B与miR-93-5p在乳腺癌、结直肠腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、在子宫体子宫内膜癌、皮肤黑素瘤和卵巢浆液性囊腺癌呈负相关。MiR-93-5p与HIF-1α、PDGF-B在肿瘤中呈负相关性,进一步的提示HIF-1α和PDGF-B可能作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥作用。3.双荧光素酶实验证实miR-93-5p能靶向结合HIF-1α,验证HIF-1α和PDGF-B可能作为miR-93-5p的靶基因在MDS中发挥生物学功能。结论1.HIF-1α在MDS骨髓组织中表达上调;且在HIF-1α(+)的患者中,MDS患者的生存时间与不良预后因素相关;再者,HIF-1α(+)有助于MDS的诊断。2.PDGF-B在MDS骨髓组织中表达上调;且在PDGF-B(+)的患者中,MDS患者的生存时间与不良预后因素相关;再者,PDGF-B(+)有助于MDS的诊断。3.在MDS中,HIF-1α和PDGF-B均表达上调,而且两者呈正相关。4.MiR-93-5p靶向结合HIF-1α;在MDS中miR-93-5p可能通过靶向结合HIF-1α和PDGF-B发挥生物学功能,但仍需后续实验加以进一步验证。
【图文】：

骨髓增生异常综合征,微环境,假说

1 微环境在骨髓增生异常综合征的发生和演变中的作用模型的简洁假说图。ure 1 A hypothetical and simplified working model for the role of the microenvironment in the init evolution of myelodysplastic syndromes.缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)是维持缺

骨髓细胞,机制研究

HIF-1α在MDS和正常对照组的骨髓细胞中mRNA表达水平
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R551.3

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