miR-322在心肌细胞缺氧—复氧损伤中的修复作用与机制研究

发布时间：2020-05-18 21:41

【摘要】：目的:研究miR-322在心肌细胞缺氧-复氧损伤中的作用及机制,本实验以干细胞定向分化为心肌细胞,通过心肌细胞缺氧-复氧实验模拟心肌梗死环境中发生的心肌缺血再灌注,希望通过此研究,为心肌损伤临床防治提供新思路。方法:1、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与胚胎干细胞(mESC-D3)培养。2、慢病毒制备与转染。构建携带目的基因的慢病毒,miR-322过表达、miR-322敲减、Celf1过表达、Celf1敲减、miR-322与Celf1同时过表达,构建后转入mESC-D3细胞中,并筛选表达目的基因的细胞。3、mESC-D3细胞定向分化为心肌细胞。将胚胎干细胞分为8组:未缺氧复氧组(Normal);野生细胞缺氧复氧组(Wild);空病毒细胞缺氧复氧组(Empty);miR-322上调细胞缺氧复氧组(322-up);miR-322下调细胞缺氧复氧组(322-down);Celf1上调细胞缺氧复氧组(Celf1-LV);Celf1下调细胞缺氧复氧组(Celf1-RNAi);miR-322和Celf1同时上调缺氧复氧组(322-up+Celf1-LV)。经由悬滴培养方法制成拟胚体,4.5d后收集拟胚体在6cm培养皿中。4、细胞缺氧复氧。分化建模成功,心肌细胞成熟时(选择分化后第8天)进行缺氧复氧处理。缺氧:5%C0_2、95%N_2 3h,复氧:5%C0_2、95%O_2 2h。5、检测指标。观察各组细胞缺复氧后状态;荧光显微镜检测各处理组心肌细胞自发搏动频率变化;通过MTT比色法检测缺复氧前后细胞存活率;检测细胞培养液中乳酸脱氢酶活性和细胞内ATP含量变化;实时定量RT-PCR,以GAPDH作为标准对照,测定各组细胞相关心肌细胞基因(OCT-4,Nkx-2.5,α-MHC,MLC-2V,Sox-2)的变化;Western blot检测各组细胞蛋白(Nkx-2.5、cTnT)的表达水平。6、统计分析。统计数据分析应用t检验评估两组差异性,P0.05。结果:1、mESC-D3细胞成功诱导分化为可以产生自发搏动的心肌细胞;2、miR-322上调、Celf1下调对干细胞分化的心肌细胞H/R损伤具有保护作用。Wild组心肌细胞搏动频率及存活率较Normal组明显降低,细胞内ATP含量降低,细胞培养液LDH活性升高,表明H/R造模成功。与对照组比较,322-up组、Celf1-RNAi组心肌细胞存活率、搏动频率增加,细胞内ATP含量升高,细胞培养液LDH活性降低,PCR结果表明多能性相关性基因(OCT-4、Sox-2)及心肌细胞基因(Nkx-2.5、MLC-2V、α-MHC)均上调,WB结果表明心肌细胞蛋白Nkx-2.5、cTnT均上调。3、miR-322通过抑制Celf1表达来达到对干细胞分化的心肌细胞H/R损伤的保护作用。与对照组比较,322-up+Celf1-LV组心肌细胞存活率、搏动频率增加,细胞内ATP含量升高,细胞培养液LDH活性降低,但各指标变化均不如322-up组明显。PCR结果表明OCT-4、Sox-2、Nkx-2.5、MLC-2V、α-MHC基因均上调,WB结果表明心肌细胞蛋白Nkx-2.5、cTnT均上调,miR-322通过调控Celf1表达,调控下游基因表达,进而调控蛋白表达,从而发挥保护心肌细胞的作用,但miR-322上调没有完全抑制Celf上调产生的调节作用,说明miR-322和Celf1中间还有复杂的机制、中间分子有待研究。结论:1、miR-322上调对缺氧复氧心肌损伤有保护作用;2、Celf1下调对缺氧复氧心肌损伤有保护作用;3、miR-322通过抑制Celf1表达来达到对缺氧复氧心肌损伤的保护作用;
【图文】：

ES细胞,实验方法,心肌细胞

ES细胞分化为心肌细胞的实验方法

细胞培养,细胞

第 3 章结果第 3 章结果3.1 细胞培养与分化3.1.1 Mef 细胞与 mESC-D3 细胞培养Mef 细胞呈梭形，胞质有多个向外延伸的突起，，作为 ESC-D3 的饲养层细胞，为 mESC-D3 细胞提供附着、营养，并能抑制其分化；mESC-D3 细胞呈团生长，排列紧密，生长于饲养层之上，生长迅速，复苏后第 2 天换液，第 4 天即可传代（1:4-1:6）。（见图 2）
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

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