Treg通过活化ILC2s改善动脉粥样硬化

发布时间：2020-05-19 09:09

【摘要】：背景和目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)引起的急性心血管疾病事件已成为人类的头号杀手。调节性T细胞是一种获得性免疫细胞,在机体免疫稳态中起着重要的调控作用。从以往的研究中可以看出,Treg在血管免疫稳态的维持和抑制AS发生发展中其重要作用。固有淋巴细胞(ILCs)是近年来发现的一类新型天然免疫细胞,在免疫反应和组织构建和修复中均发挥着重要作用。根据最新研究表明ILC2s可能减缓动脉粥样硬化发生发展。但Treg是否通过调控ILC2s活化进而抑制AS目前国内外均无研究。所以,在本研究中,我们旨在研究Treg在动脉粥样硬化病理过程中的作用机制,其是否通过活化ILC2s改善动脉粥样硬化疾病。方法:1.ApoE-/-小鼠高脂饮食16周同时过继转输Tregs,通过油红O染色主动脉和主动脉根部,组化染色Masson,CD68,α-SMA主动脉根部,研究Treg对动脉粥样硬化的影响。2.分选CD4~+Foxp3(GFP)~+Treg细胞和ILC2s细胞(Lin~-CD45~+ICOS~+CD127~+CD25~+),体外共培养,通过ELISA检测ILC2s分泌IL-5,IL-13量,体外研究Treg对ILC2s影响。3.ApoE-/-小鼠高脂饮食16周同时过继转输Tregs,通过流式分析检测脾脏,骨髓和PaLN中ILC2s比例和数量,体内研究Treg对ILC2s的影响。4.向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射anti-CD90.2,IL-2/Jes6-1,PBS同时高脂饮食16周,流式分析检测脾脏中ILC2s比例,验证敲除和扩增ILC2s;油红O染色主动脉和主动脉根部,组化染色Masson,CD68,α-SMA主动脉根部,研究ILC2s对动脉粥样硬化的影响。5.ApoE-/-Rag1-/-小鼠高脂饮食16周过继转输Tregs,流式分析检测脾脏和骨髓中ILC2s比例和数量,研究Treg对ILC2s的影响;ApoE-/-Rag1-/-小鼠高脂饮食16周同时过继转输Treg细胞或过继转输Treg同时腹腔注射anti-CD90.2,油红O染色主动脉和主动脉根部,组化染色Masson,CD68,α-SMA主动脉根部,,研究Treg通过ILC2s进而对动脉粥样硬化的影响。6.CD4~+Foxp3~+Treg细胞和ILC2s共培养时加入anti-IL-10和或anti-TGF-Β抗体;CD4~+Foxp3~+Treg细胞和ILC2s进行transwell培养;通过ELISA检测ILC2s分泌IL-5,IL-13量,研究Treg活化ILC2s的作用机制。结果:1.ApoE-/-小鼠高脂饮食16周同时过继转输Treg,油红染色主动脉斑块面积减少,主动脉窦斑块面积减少,斑块内巨噬细胞数量减少,胶原升高,而平滑肌无变化。2.通过ELISA检测ILC2s分泌IL-5,IL-13量,细胞实验表明Treg能促进ILC2s分泌IL-5,IL-13。3.ApoE-/-小鼠高脂饮食16周同时过继转输Tregs,Treg能够升高ILC2s比例和细胞数量。4.向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射IL-2/Jes6-1,油红染色主动脉斑块面积减少,主动脉窦斑块面积减少,斑块内巨噬细胞数量减少,胶原升高,而和平滑肌无变化。向ApoE-/-Rag1-/-小鼠腹腔注射anti-CD90.2,油红染色主动脉和主动脉窦斑块面积,斑块内巨噬细胞数量,胶原升高和平滑肌均无变化。5.ApoE-/-Rag1-/-小鼠过继转输Treg同时高脂饮食16周,Treg能够升高ILC2s比例和细胞数量;与PBS相比,在ApoE-/-Rag1-/-小鼠过继转输Treg,整根主动脉内斑块面积减少,主动脉窦斑块损伤下降,斑块内巨噬细胞减少,胶原比例升高;与过继转输Treg同时腹腔注射antiCD90.2相比,在ApoE-/-Rag1-/-小鼠过继转输Treg,整根主动脉内斑块面积减少,主动脉窦斑块损伤下降,斑块内巨噬细胞减少,而胶原和平滑肌比例无变化。6.CD4~+Foxp3~+Treg细胞和ILC2s共培养时加入anti-IL-10和或anti-TGF-Β抗体,通过ELISA检测细胞因子,细胞实验表明Treg通过分泌IL-10和TGF-Β机制活化ILC2s,而CD4~+Foxp3~+Treg细胞和ILC2s进行transwell培养,表明Treg通过细胞接触方式活化ILC2s。讨论:通过以上研究,我们可以得到以下结论:1.Treg延缓动脉粥样硬化2.在体内和体外实验,CD4~+Foxp3~+Treg均能增加ILC2细胞数量和促进分泌IL-13。3.ILC2s延缓动脉粥样硬化。4.Treg通过活化ILC2s进而抑制动脉粥样硬化。5.CD4~+Foxp3~+Treg通过分泌IL-10,TGF-Β和细胞接触方式活化ILC2s。
【图文】：

活化和瑞氏姬姆萨染色 ILC2s在 C57BJL/6 小鼠脾脏中分选 ILC2（7-AAD-CD45+Lin-ICOS+CD127+CD25+）（图2A）根据文献报道，ILC2s 具有淋巴细胞特性即高核质比[7 31 32]和 IL-33能够活化 ILC2s[7 33-36]，，于是我们将分选得到 ILC2s 进行瑞氏吉姆萨染色和用 IL-2，IL-33 刺激，并用 ELISA 方法验证其活化。结果显示：瑞氏吉姆萨染色分选后的 ILC2s,显示具有细胞质染色浅，细胞核染色深及高核质比的淋巴细胞特性（图 2B），ILC2s 受 IL-2 和 IL-33 刺激较 medium 培养其分泌IL-5 和 IL-13 量均（图 2C 和 D）升高。表明 ILC2s 是一种淋巴细胞且 IL-13能够活化 ILC2s。

24图 3：在体外实验水平，Treg 具有扩增 ILC2s 和促进 ILC2s 分泌细胞因子功能。A：从 8 周 Foxp3GFP雄鼠脾脏分选 CD4+Foxp3(GFP)+Treg 流式代表图;B 分选后CD4+Foxp3(GFP)+Treg 纯度流式代表图; CD4+Foxp3+Treg（4×105细胞/孔）在 96孔 培 养 板 内 不 受 (Rest Treg) 或 者 受 （ Activated Treg ）anti-CD3(5ug/ml),anti-CD28(2ug/ml)和 IL-2（200U/ml）刺激 3 天，C： ELISA分别检测 Activated Treg 组（n=6）和 Rest Treg 组（n=6）的上清液中 IL-10,TGF-
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5

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本文编号：2670665