衰老的PASMCs旁分泌IL-6促进肺高压肺动脉平滑肌细胞增殖

发布时间：2020-05-21 23:26

【摘要】：背景和目的肺血管中膜增厚是肺动脉高压肺血管重构病理改变的重要原因,可由肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMCs)增殖、分泌活性增强而导致。细胞衰老是以细胞生长、增殖能力不可逆丧失为主要特征的一个过程。文献报道,在慢性阻塞性肺疾病肺血管重构中PASMCs衰老显著增加,但机制尚未阐明。我们预实验发现,低氧处理后,β-半乳糖苷酶染色的阳性细胞显著增加以及衰老指标p21的表达显著上调。这就表明,低氧可促进PASMCs衰老。然而衰老的PASMCs是如何促进肺动脉平滑肌细胞增殖尚不清楚。研究证实,衰老的主动脉平滑肌细胞通过分泌SASP(IL-1α)促进动脉粥样硬化的发生发展;衰老也可上调主动脉平滑肌细胞中IL-6的分泌和CCL2的产生,引起慢性炎症促进动脉粥样硬化。重要的是,在慢性阻塞性肺疾病中PASMCs衰老伴随IL-6表达上调,进而参与调节PASMCs增殖。我们预实验发现:低氧诱导的PASMCs衰老中,伴随IL-6表达显著增高。因此,我们推测在低氧诱导的PASMCs衰老中,衰老的PASMCs可通过旁分泌IL-6促进PASMCs增殖,进而促进PH肺血管重构。本课题通过细胞培养实验证明PASMCs衰老在低氧诱导PH肺血管重构中的重要作用并进一步验证衰老PASMCs可旁分泌IL-6促进PASMCs增殖,导致PH肺血管重构。以PASMCs衰老可能是肺动脉高压肺血管重构一种新的病理生理机制为切入点,揭示PASMCs衰老对低氧诱导PH肺血管重构的作用。为进一步研究如何减轻肺动脉平滑肌细胞衰老来抑制肺动脉平滑肌细胞增殖,进而抑制肺动脉高压肺血管重构提供新的策略。方法采用第3代至第8代SD大鼠原代PASMCs,分别在常氧(21%O_2)和低氧(3%O_2)处理48 h,建立PASMCs低氧模型。(1)使用免疫组化法鉴定平滑肌α-肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)。(2)细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞内β-半乳糖苷酶活性,并计算阳性率;Western blot检测衰老指标p21、p16蛋白水平,检测细胞衰老情况。(3)CCK8检测PASMCs增殖率;Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达水平。qPCR法检测增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA表达水平。(4)ELISA试剂盒检测细胞上清液IL-6旁分泌情况。结果(1)分离培养的PASMCs,3天后可见PASMCs贴壁生长,形态呈长梭形,7天后呈典型的“峰-谷”状生长,10天左右细胞达90%以上的融合。在倒置显微镜下对细胞进行形态学分析以及免疫组化法的阳性结果判断培养的原代细胞为PASMCs;(2)低氧组(3%O_2)较常氧组相比,细胞内β-半乳糖苷酶阳性率明显升高(P0.05);衰老指标p21、p16蛋白表达水平明显增加(P0.05,P0.01);(3)较常氧组相比,低氧组(3%O_2)PASMCs的增殖率增加,PCNA蛋白表达水平明显上调(P0.05);低氧组(3%O_2)PASMCs中PCNA mRNA表达水平明显上调(P0.05);(4)低氧组(3%O_2)中细胞上清液IL-6表达较常氧组明显上调(P0.01);(5)IL-6抑制剂AX-024处理后,细胞上清液IL-6表达水平明显下调(P0.001),且处理浓度为10 nmoL/mL时具有最佳抑制作用(P0.05)。结论1.低氧可诱导PASMCs衰老。2.衰老的PASMCs可通过分泌细胞因子IL-6促进PASMCs增殖。
【图文】：

PH 肺血管重构的影响。即低氧诱导 PH 中 PASMCs 的衰老增加，衰老的PASMCs 可通过分泌衰老相关分泌表型 IL-6 促进 PASMCs 增殖，从而促进PH 肺血管重构，为防治 PH 肺血管重构提供新的靶点和新的策略（图1）。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R544.1

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