Klotho修饰的骨髓间充质干细胞抑制腹主动脉瘤的机制研究

发布时间：2020-05-23 21:41

【摘要】：目的:本研究将分泌型Klotho(sKL)转染至骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)内,通过静脉注射的方式将sKL修饰的BMSCs移植至已构建的腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)大鼠模型中。通过细胞培养、病毒制备、组织形态学和Western Blot等实验方法,观察腹主动脉管壁的变化及与衰老、炎症、氧化应激等相关蛋白的表达情况,以探讨分泌型sKL修饰的BMSCs在AAA修复中可能发挥的作用及相关机制,为AAA的治疗提供新的思路。方法:1、体外条件下培养大鼠BMSCs,将其分为3组:N组、GFP组、sKL组。N组作为正常对照组,不作任何处理。GFP组、sKL组分别感染GFP空载重组慢病毒、携带Klotho基因的慢病毒表达载体,应用荧光显微镜观察感染效率,蛋白免疫印迹法(Western Blot)技术分别对培养细胞中sKL、P21与P53以及培养基中sKL进行定量分析。2、将Wistar大鼠随机分为五组:N组、AAA组、MSC组、GFP组、sKL组。N组作为正常对照组,不作任何处理;其余4组进行AAA模型制作,其中AAA组作为AAA实验组,模型制作完成后不作处理,MSC组、GFP组、sKL组在完成AAA模型后即尾静脉分别注射BMSCs、携带GFP的BMSCs、sKL过表达的BMSCs,每周注射一次(1x10~6个),四周后取血液和腹主动脉,进行相关指标检测。3、测量动脉管径,检测过表达sKL的BMSCs是否浸润动脉病灶区域;通过HE染色、地衣红染色和Masson染色分别观察动脉管壁的总体变化、弹力板与胶原纤维的形态。通过β-Gal染色对衰老细胞进行了定位和半定量分析,通过免疫组化技术分别对各组动脉组织中SIRT1、CD45、CD68、α-SMA进行定位和半定量分析,Western Blot技术对血清中sKL以及各组动脉组织中SIRT1、P21、P53、NF-κB、P-AMPKα、AMPKα、MMP-2、MMP-9进行定量分析。结果:1、荧光显微镜镜下观察BMSCs感染效率,Western Blot检测BMSCs及其培养基中sKL的含量,其中sKL组相较于N组和GFP组显著增高。MTT结果表明sKL对BMSCs的增殖无显著影响。Western blot检测BMSCs中衰老标志物P53、P21。结果表明,sKL可下调BMSCs中P53、P21的表达。2、AAA模型4周后取材,直径测量结果可知,AAA组相较于N组明显扩张,且呈现明显的钙化,MSC组、GFP组以及sKL组相对AAA组明显减轻,sKL组达到最佳的治疗效果。HE染色观察腹主动脉管壁的形态,由结果可知AAA组较N组动脉管径增大,伴管壁变薄、破裂,治疗组相对于AAA组有很大的改善,其中sKL组效果最佳。地衣红染色表明,AAA组弹力板断裂明显,sKL组可显著抑制动脉管壁弹力板的断裂。Masson染色结果可知,AAA组动脉管壁平滑肌细胞明显减少,中膜处胶原纤维明显增多,sKL组与AAA组相比,平滑肌细胞明显增多。3、Western Blot检测大鼠血清中sKL水平,AAA组中sKL含量相较于N组明显降低,治疗组相对AAA组明显升高。4、SIRT1免疫组化及Western Blot结果表明,其主要定位于血管中膜平滑肌细胞,在AAA组中,SIRT1明显下降,治疗组与AAA组相比SIRT1含量上升,其中sKL组显著上升。5、β-Gal衰老细胞染色结果可知,AAA组有大量衰老细胞,治疗组衰老细胞明显减少,sKL组可显著降低细胞衰老。α-SMA免疫荧光结果可知,N组平滑肌细胞数量很多,AAA组明显减少,MSC组及GFP组可看出平滑肌细胞数量较AAA组增加,sKL组接近于正常水平。Western Blot检测AAA组织中P53、P21的表达,结果显示,AAA组中P53、P21高表达,治疗组中逐渐下降,sKL组明显下降。6、免疫组化检测AAA组织中炎症细胞CD45、CD68的表达,结果表明阳性细胞主要定位于动脉壁外膜,AAA组中有大量炎症细胞浸润,治疗后浸润炎症细胞减少,其中sKL组最少。Western Blot结果显示,NF-κB在N组中少量表达,而在AAA组高表达,治疗组水平降低,而在sKL组中下调最为明显。7、DHE检测活性氧含量发现,AAA组中有大量的活性氧,治疗组逐渐下降,sKL组接近于正常水平。Western Blot检测氧化应激相关蛋白P-AMPKα及AMPKα在动脉中表达,结果显示,AAA组P-AMPKα水平低于N组,治疗组含量相对上升,sKL组中明显上升。8、Western Blot证实,AAA组中MMP-2和MMP-9表达上调,治疗组均下降,sKL组较为显著。结论:过表达sKL的BMSCs具有抑制AAA病理性扩张的作用,其作用可能是通过抑制动脉管壁细胞衰老、炎症反应及氧化应激反应实现。
【图文】：

慢病毒,荧光显微镜,标尺,荧光

中国医科大学硕士学位论文3 实验结果3.1 Klotho 对 BMSCs 增殖的影响3.1.1 过表达 Klotho 的 BMSCs 构建Klotho 是一种衰老抑制基因，在衰老相关疾病的发生中发挥着重要的作用。我们将 Klotho 稳转至 BMSCs，以此来探究 sKL 对 BMSCs 的影响。荧光倒置显微镜镜下观察各组细胞可见，GFP 组和 sKL 组中有大量绿色荧光，N 组未见荧光，表明包装 Klotho 慢病毒已成功感染至 BMSCs（图 1）。N GFP sKL

腹主动脉,HE染色,标尺,中膜

中国医科大学硕士学位论文腹主动脉 HE 染色结果可见，N 组动脉壁排列规则；AAA 组蓝色病变部位表明大量钙沉积，同时管壁变薄、中膜破裂、管径较正常组明显扩张；MSC 组和 GFP 组同 AAA 组相比中膜破损情况得到明显改善；sKL 组腹主动脉结构已接近正常 N 组，，管径略微扩张（图 6、图 7）。N AAA MSC
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.1

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