miR-327靶向调控RP105在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-25 02:31

【摘要】：目的:通过腺病毒载体上调和下调大鼠心肌组织中miR-327的表达,探讨其在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中的作用及其分子机制。方法:(1)腺病毒转染:将60只健康雄性SD大鼠随机分为5组,分别为假手术组(Sham组,生理盐水+假手术)、缺血/再灌注损伤组(I/R组,生理盐水+I/R)、miR-327抑制组(Ad-miR-327-i组,Ad-miR-327-RNAi+I/R)、腺病毒空载组(Ad-NC组,Ad-EGFP+I/R)和miR-327过表达组(Ad-miR-327组,Ad-miR-327+I/R)。Sham组和I/R组心尖多点注射等量生理盐水,Ad-miR-327-i组、Ad-NC组和Ad-miR-327组心尖多点注射相应的腺病毒,稳定转染3天后建立大鼠MIRI模型。(2)荧光显微镜观察腺病毒转染效率。(3)建立大鼠MIRI模型:结扎冠状动脉左前降支(LAD)缺血30 min,再灌注3 h,Sham组在对应的位置只穿线不结扎,收集血液和心肌组织标本进行检测。(4)全自动生化分析仪检测血清心肌酶LDH和CK-MB的含量。(5)TTC染色测定相对心肌梗死面积。(6)HE染色评估心肌组织形态学改变。(7)Real-time PCR检测miR-327和RP105基因的表达。(8)Western blot检测RP105、TLR4、TLR2、MyD88和NF-κB-p65蛋白的表达。(9)ELISA检测心肌组织中IL-6和TNF-α的含量。(10)双荧光素酶报告基因检测miR-327与RP105的靶向作用关系。结果:(1)腺病毒成功转染至大鼠心肌组织:与注射生理盐水的Sham组和I/R组相比,Ad-miR-327-i、Ad-miR-327和Ad-NC组心肌组织中有较强的绿色荧光蛋白表达。(2)成功建立大鼠MIRI模型:与LAD结扎前相比,结扎后Ⅱ导联ST段抬高、T波高耸;与Sham组相比,I/R组心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面积显著增加(均P0.05);HE染色示Sham组心肌纤维排列规则,无细胞水肿、肌纤维断裂及炎性细胞浸润,I/R组可见心肌纤维排列紊乱、细胞水肿、肌纤维断裂及炎性细胞浸润。(3)下调miR-327可减轻MIRI:与Ad-NC组相比,Ad-miR-327-i组心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面积明显降低,Ad-miR-327组心肌酶LDH、CK-MB及心肌梗死面积明显升高(均P0.05);HE染色示Ad-NC组心肌纤维排列紊乱、细胞水肿及炎性细胞浸润,Ad-miR-327-i组的细胞水肿及炎性细胞浸润得到改善,Ad-miR-327组心肌损伤加重。(4)下调miR-327可促进RP105的表达:与Sham组相比,I/R组心肌组织中miR-327的表达明显增加,RP105的表达明显降低(均P0.05);与Ad-NC组相比,Ad-miR-327-i组心肌组织中miR-327的表达明显降低,RP105的表达明显升高,而Ad-miR-327组心肌组织中miR-327的表达明显升高,RP105的表达明显降低(均P0.05)。(5)下调miR-327可抑制TLR4/TLR2-MyD88信号通路的激活:与Sham组相比,I/R组TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB-p65、IL-6和TNF-α的表达明显升高(均P0.05);与Ad-NC组相比,Ad-miR-327-i组TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB-p65、IL-6和TNF-α的表达显著降低,而Ad-miR-327组上述分子的表达明显升高(均P0.05)。(6)miR-327靶向作用于RP105的3'UTR:双荧光素酶报告基因检测结果显示,与3'UTR-NC+miR-327组相比,3'UTR+miR-327组的荧光素酶活性明显降低(P0.05)。结论:下调miR-327可通过靶向调节RP105-TLR4/TLR2-MyD88信号通路对MIRI发挥保护作用。
【图文】：

模式图,信号通路,模式图,炎性细胞因子

三峡大学全日制专业学位硕士学位论文（myeloid differentiation factor, MyD88）和toll样受体接头蛋白1（toll-like receptoradaptor molecule 1, TRIF）相互作用，激活MyD88依赖的和TRIF依赖的信号通路，最终促进白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎性细胞因子的产生[11,13]（图1）。释放的炎性细胞因子，通过促进中性粒细胞的活化、募集、黏附和浸润，维持炎症反应过程，进一步加重MIRI。本课题组前期研究发现，在缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）心肌组织中，TLR4、MyD88、NF-κB、IL-6和TNF-α的表达显著升高[5,14]，而依立托伦通过抑制TLR4信号通路的激活可减轻MIRI[15]。本课题组近期研究也发现，在IRI心肌组织中，TLR2的表达升高，TLR2-MyD88信号通路被激活。因此，以TLR4/TLR2- MyD88信号通路为切入点，寻找内源性干预因子，可能是防治MIRI的有效靶点。

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对IRI心肌组织发挥保护作用。微小RNA（micoRNA, miRNA）包含20-22个核苷酸序列，可以与目标mRNA的3'端非翻译区（3' untranslated region , 3'UTR）碱基配对结合，对目标基因发挥调控作用（图2）。多项研究表明，miRNA在MIRI中发挥重要作用，如miR-15和miR-92a可加重MIRI，而miR-17-3p，miR-210和miR-223在MIRI中发挥保护作用[19-23]。也有研究表明，在糖尿病大鼠的心脏微血管内皮细胞、IRI心肌组织及IRI肾脏组织中，miR-327表现为2-10倍的升高[24-26]。同时，Ji等[27]研究发现，下调miR-327可通过靶向作用于整合素β3减轻心肌肥厚和心肌纤维化。通过生物信息学分析发现，IRI心肌组织中升高的miR-327可能对RP105具有靶向调控作用。因此，我们推测IRI心脏组织中上调的miR-327可能通过作用于RP105的3'UTR，，抑制RP105的表达，促进TLR4/TLR2信号通路的活化，进而加重MIRI。因此，本课题组拟通过构建可上调或下调miR-327表达的病毒载体，心尖多点注射诱导miR-327在大鼠心肌组织中下调和过表达，探讨miR-327对大鼠MIRI的作用，以及miR-327靶向调节RP105-TLR4/TLR2-MyD88信号通路的分子机制。
【学位授予单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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