miR-146a对脂多糖诱导的内皮细胞中CXCL16表达的调节机制研究

发布时间：2020-05-31 22:17

【摘要】：目的:动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的始动环节,CXC趋化因子配体16(CXCL16)作为黏附分子、趋化因子及清道夫受体参与其中。我们的研究目的在于探索(1)炎性损伤因素脂多糖(LPS)是否影响内皮细胞CXCL16表达及其作用途径;(2)与炎症及动脉粥样硬化相关的miR-146a对LPS诱导的CXCL16表达的调控及作用机制。方法:采用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予LPS炎性刺激,构建炎性细胞模型;通过生物信息学网站预测miR-146a作用靶点;通过脂质体转染miR-146a模拟体(miR-146a mimics)或miR-146a抑制剂(miR-146a inhibitors),过表达或抑制内皮细胞中miR-146a表达;通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法观察内皮细胞活性变化,免疫荧光观察细胞转染情况;采用分子生物学技术酶联免疫分析法(ELISA)检测细胞上清液中CXCL16表达,蛋白印迹(Western blotting)检测细胞CXCL16及信号通路分子Toll样受体4(TLR4)、核转录因子κB(NF-κB)蛋白表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-146a表达水平。结果:(1)利用浓度梯度(0-10ug/mL)及时间梯度(0-48h)的LPS干预HUVECs,与空白对照组相比,在1、3、10ug/mL(24h)及6、12、24、48h(1ug/mL)内皮细胞活性明显降低(P0.05);CXCL16在LPS浓度1ug/mL时释放及表达增加,时间越长,内皮细胞释放及表达CXCL16明显增加(P0.05)。(2)利用LPS诱导HUVECs,检测信号通路TLR4、phosphor-NF-κB p65、NF-κB p65是否被激活。结果显示,TLR4、phosphor-NF-κB p65在1ug/mL LPS浓度下表达明显增加;在作用时间上,TLR4及phosphor-NF-κB p65均在24小时变化明显(P0.05)。给予TLR4的抑制剂TAK-242(10uM,12h),阻断TLR4后,选择1ug/mL的LPS继续干预24小时,与空白组相比,TAK-242抑制剂组TLR4及下游NF-κB表达明显减少;并且TAK-242抑制剂组,细胞释放及表达CXCL16相较于空白组明显降低(P0.05)。(3)利用LPS诱导HUVECs,检测miR-146a表达。与空白对照相比,LPS能够诱导miR-146a表达明显增加(P0.05)。进一步,通过转染上调及下调miR-146a表达后,检测CXCL16的表达变化。结果显示,转染miR-146a mimics,上调miR-146a表达后,相较其对照组,CXCL16表达明显下降;相反的,转染miR-146a inhibitors,抑制miR-146a作用,CXCL16表达高于其对照组(P0.05)。(4)通过转染上调及下调miR-146a后,检测TLR4及phosphor-NF-κB p65表达。结果显示,转染miR-146a mimics组,上调miR-146a表达后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表达下降;相反,miR-146a inhibitors组在抑制miR-146a后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表达增加。我们在给予TLR4的抑制剂TAK-242(10uM,12小时)基础上,同时转染miR-146a inhibitors,检测TLR4/NF-κB通路,及CXCL16的表达变化。结果显示抑制剂TAK-242明显阻断了miR-146a inhibitor干预后上清及细胞高表达的CXCL16,并且TLR4、phosphor-NF-κB p65通路蛋白有相同的趋势(P0.05)。结论:(1)LPS能够诱导内皮细胞CXCL16释放及表达增加;(2)LPS通过TLR4/NF-κB信号通路调节HUVECs中CXCL16表达变化;(3)在LPS诱导下HUVECs中,miR-146a表达增加,通过作用于TLR4,负反馈调控CXCL16的表达。
【图文】：

脐静脉内皮细胞,光镜,盖片,悬液

（1）将血球计数板擦拭干净，并将盖玻片置于计数板上；（2）制备悬液：按照 2.2.2 中方法进行，镜下观察呈单细胞悬液；（3）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，注意盖片下不要有气泡；（4）统计：统计计数板外周 4 格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的；（5）计算细胞数：按照公式计算细胞密度：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104。2.2.5 细胞活性检测使用 Cell Counting Kit-8 进行细胞活性检测，具体步骤参照 Cell Counting Kit-8（MCE）说明书。（1）在 96 孔板中接种 HUVECs 悬液(100 μL/孔，细胞密度约 6-8×103/mL)，将培养板放在培养箱中培养 24 小时；（2）向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；（3）将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；（4）分别在 1、2、3、4h 时使用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度（OD 值）。

人脐静脉内皮细胞,图像,荧光显微镜,视野

图 2 人脐静脉内皮细胞转染镜下观察（a 光镜镜下图像，b 同视野荧光显微镜镜下图像）2.4 分子生物学实验2.4.1 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 miR-146a 表达（1）RNA 提取① 细胞裂解：吸取培养基，加冰 PBS 冲洗 2 遍；加 Trizol 裂解液（每 10cm2加入 1mL），轻微研磨混匀处理；② 提取 RNA：将匀浆液移至 EP 管中，加入 200μL 的氯仿（1/5 体积的 Trizol），旋涡振荡 15 秒，，冰上静置 10min，待分层； 4℃，12000rpm 离心 15min，匀浆液分至 3 层；③ 沉淀 RNA：取上层上清液，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静止 20min；4℃，12000rpm 离心 15min，可见 RNA 沉淀；④ 洗涤 RNA：去除上清，加入等 Trizol 体积的 75%乙醇溶液（DEPC 水 25% + 75%无水乙醇），轻微混匀；4℃，7500rpm 离心 10min，可见 RNA 沉淀；可重复
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5

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