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人脐带间质干细胞来源exosomes修复急性心肌梗死损伤机制研究

发布时间:2020-06-02 18:58
【摘要】:目的:本实验室前期研究发现人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)来源的exosomes(hucMSCs-exosomes)能够有效修复急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)心肌损伤,但其具体作用机制不明。本研究将在前期研究基础上进一步探讨hucMSCs-exosomes修复心肌损伤的潜在机制。方法:采取组织块贴壁培养法培养hucMSCs并收集培养上清;超滤结合蔗糖重水梯度密度离心法分离纯化hucMSCs-exosomes,并利用纳米颗粒分析仪和Western blot进行鉴定;在采用结扎冠状动脉左前降支法构建SD大鼠AMI模型基础上通过尾静脉输注hucMSCs-exosomes治疗2天和4周后,通过超声心动图、HE染色和Western blot检测hucMSCs-exosomes对心肌损伤的修复作用;体外构建H9C2(2-1)心肌细胞缺血缺氧损伤模型,乳酸脱氢酶(LDH)释放检测、台盼蓝染色和Western blot检测hucMSCs-exosomes对心肌损伤的修复作用;同时,Western blot检测hucMSCs-exosomes修复心肌损伤过程中Smad7的表达变化;利用生物信息学预测调节Smad7表达的miRNA,并通过定量PCR和双荧光素酶报告基因系统进行验证;将H9C2(2-1)心肌细胞转染miR-125b-5p mimics再缺血缺氧48h,通过Western blot检测Smad7、Bax和Bcl-2的表达以及LDH释放检测,分析exosomes修复心肌损伤的可能机制。结果:本研究成功分离hucMSCs及hucMSCs-exosomes,纳米颗粒分析显示hucMSCs-exosomes直径在134nm左右,最终浓度约为4.17±0.22×10~(10) particles/ml,表达CD9、CD63和CD81等exosomes相关蛋白标志物;体内hucMSCs-exosomes输注能够提高SD大鼠AMI模型心脏的收缩能力,改善心肌损伤;体外hucMSCs-exosomes能明显抑制H9C2(2-1)心肌细胞缺血缺氧损伤导致的细胞凋亡;并发现体内外心肌损伤后Smad7表达量明显下降,而hucMSCs-exosomes能上调损伤心肌细胞的Smad7表达;生物信息学预测结果表明miR-125b-5p调节Smad7的表达,使用miR-125b-5p mimics转染H9C2(2-1)心肌细胞再缺氧48h后,相比较于MNC+hypoxia组,miR-125b-5p mimics+hypoxia组的心肌细胞表达Smad7明显下调,并导致心肌细胞损伤更加明显,hucMSCs-exosomes在一定程度上缓解了这种现象。结论:HucMSCs-exosomes能够有效修复AMI心肌损伤,其可能的机制是hucMSCs-exosomes通过抑制miR-125b-5p上调Smad7表达促进心肌修复。
【图文】:

倒置显微镜,标尺,形态,蛋白


然后保存到-80 C。制备 12%的 SDS-PAGE 凝胶,将g 蛋白上样量进行加样,电泳(积层胶 80V,分离胶 120V),,胶下沿进行转膜,将蛋白用 350mA 恒流 90min 电转到 PVDF脱脂牛奶封闭2h,按照抗体说明书将抗体稀释,蛋白条带4 C 过×TBS/T 在摇床上清洗三次,每次 10min。再用相对应的二抗(记)37 C 孵育 1h,1×TBS/T 洗膜。最后使用超敏 ECL 发光系分析蛋白表达情况。ucMSCs 的形态特征显微镜下观察 hucMSCs(第三代)呈均匀分布的长梭状生长(

浓度分布,表达蛋白,分子,标志物


图 3.2 hucMSCs-exosomes 经 NTA 检测的结果A、B. hucMSCs-exosomes 经 NTA 分析的颗粒大小、浓度分布及其百分比C. 不同批次 hucMSCs-exosomes 的蛋白浓度及微粒浓度Fig 3.2 The results of hucMSCs-exosomes detected by NTAA. Particle size distribution and B. particle concentration were analyzed by nanoparticacking analysis. C. Protein concentration and particle concentration of hucMSCs-exosomevarious batches..3 HucMSCs-exosomes 表达分子标志物分 别 提 取 分 离 hucMSCs-exosomes 后 的 hucMSCs-CM 、 hucMSCcMSCs-exosomes 总蛋白,Western blot 检测 exosomes 的相关标志物 CD9、C CD81,结果显示,hucMSCs-exosomes 表面三种蛋白的表达均为阳性(图 3.
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R542.22

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本文编号:2693615

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