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AGEs诱导自噬促进人主动脉血管平滑肌细胞钙化

发布时间:2020-06-02 22:30
【摘要】:目的:探讨细胞自噬在晚期糖基化终末产物(advance glycation end products,AGEs)诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HAVSMCs)钙化中的作用机制。方法:在此项研究中,选用第5-8代人主动脉血管平滑肌细胞进行实验。将人主动脉血管平滑肌细胞分为对照组及钙化组,钙化组使用40mg/L AGEs诱导4天。使用Western Blot检测两组细胞中OPG、OPN、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平。按AGEs干预细胞的时间不同将实验分组为A1组(40mg/L AGEs干预1天)、A2组(40mg/L AGEs干预2天)、A3组(40mg/L AGEs干预3天)、A4组(40mg/L AGEs干预4天),分别使用Western Blot检测各组细胞中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平,再使用免疫荧光法检测各组细胞内LC3表达差异。ELISA法检测各组细胞内ALP活性。然后,将实验分为对照组、自噬抑制组及钙化组,自噬抑制组使用1μmol/L渥曼青霉素(Wortmannin)+40mg/L AGEs干预4天,钙化组仍以40mg/L AGEs干预4天。Western Blot检测各组细胞中OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白的表达水平。ELISA法检测各组细胞内ALP活性。冯-库萨染色法检测细胞钙化程度。为探索相关信号通路与自噬的关系,使用Western Blot法分别对照组与AGEs组中PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白的表达水平进行检测。结果:1.钙化组OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白的表达水平相较对照组明显增高(P0.05)。2.A1组、A2组、A3组、A4组中OPG、LC3II、Beclin1、P62蛋白水平依次升高(P0.05),ALP活性也依次升高(P0.05)。各组细胞内LC3II荧光斑点也随干预时间增加而增加。3.自噬抑制组的OPG、OPN、RUNX2、LC3II蛋白表达水平相较于钙化组降低,而相较于对照组增高(P0.05)。ALP活性及冯-库萨染色检测的细胞钙化程度也呈此趋势。4.相较于对照,AGEs组的PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平增高(P0.05)。结论:1.AGEs诱导人主动脉血管平滑肌细胞钙化与自噬,且呈时间依耐性。2.自噬促进AGEs诱导人主动脉血管平滑肌细胞钙化。3.AGEs可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进自噬从而促进人主动脉血管平滑肌细胞钙化。
【图文】:

荧光检测,相差显微镜,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜


- 23 -细胞形态及免疫荧光染色:A、B、C 为细胞在倒置相差显微镜下形态,,放为 40 倍、100 倍和 200 倍 D:在激光共聚焦显微镜下荧光检测细胞内α-S 1 Cell morphology and immunofluorescence:A, B, and C are the morphology nder an inverted phase contrast microscope, and the magnifications are 40, 100mes respectively. D: Fluorescence detection of α-SMA under a laser concope.Es 对 HAVSMCs 钙化的影响 HAVSMCs 分别加入等量的生理盐水、40mg/L AGEs 培养 4

细胞内,自噬,相关蛋白,对照组


- 25 -estern Blot 法测得细胞内 LC3II、Becl1 表示 AGEs 组与对照组相比较:Figure shows the expression levels Western Blot. Note: **P<0.01;***P<with the control group.干预不同时间对 HAVSMCs 自噬、AVSMCs 加入 40mg/LAGEs,分(A3 组)、4 天(A4 组)。提取噬相关蛋白 LC3II、Beclin1、P6Control AGEs
【学位授予单位】:西南医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R54

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本文编号:2693856

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