原花青素对小鼠后肢缺血肌肉的作用及miR-133b的表达变化与作用机制

发布时间：2020-06-04 13:45

【摘要】：目的:肢体缺血后,肌卫星细胞(Myosatellite cells,SCs)通过成肌分化过程,参与修复损伤的骨骼肌。而缺血后的氧化应激反应是影响肌肉损伤和修复的主要因素,减少氧化应激反应可能成为缺血肢体治疗的重要策略。原花青素(Proanthocyanidins,PC)具有抗氧化和清除自由基的作用,在肌肉缺血损伤与修复中发挥着保护作用,但是原花青素的具体保护机制尚未阐明。微小RNAs(miRNAs)是一类小的非编码的单链核苷酸序列,主要与靶mRNA结合起负性调控作用。肌源性miRNAs与肌肉损伤后肌纤维的再生过程密切相关,而其是否参与原花青素对缺血骨骼肌的作用及具体机制尚不明确。因此本研究通过构建简单且稳定的后肢缺血(Hind limb ischemia,HLI)小鼠模型,探究原花青素对缺血肌肉的作用,筛选miRNAs的表达谱变化,研究差异表达miRNA的功能,初步探讨miRNAs在原花青素与下肢肌肉缺血过程中的作用。第一部分,方法:32只10-12周龄的雄性C57/BL6小鼠,随机平均分为4组。通过结扎不同位点,建立后肢缺血模型:1)双重结扎并离断左侧股动脉的起点和远端分叉处(移行为乆动脉和隐动脉),根据经典文献方法建立model-1,并作为对照组;2)只双重结扎并离断股动脉远端分叉处,参照文献建立model-2的模型方法;3)只双重结扎并离断旋髂浅动脉与股深动脉之间的股动脉,以建立新的model-3方法;4)结扎离断近端的旋髂浅动脉与股深动脉间的股动脉,和股动脉的远端分叉处。建立另一种新的model-4后肢缺血方法。通过激光多普勒仪评估术后缺血肢体的血流灌注恢复情况,并使用运动机能评分评估缺血肢体运动功能障碍的恢复情况。收集缺血侧腓肠肌进行石蜡包埋切片,然后进行苏木素-伊红(HE)染色,计算再生肌纤维(中心核型)占所有肌纤维的比例,以评估缺血程度对骨骼肌再生的影响。使用石蜡切片再进行CD31的免疫荧光染色,用于评估缺血程度对新生血管的数量的影响。结果:4种模型小鼠的缺血侧肢体的血流灌注水平,均在术后立即下降超过75%,且无明显差异。model-2和model-3的血流再灌注和缺血肢体运动功能的恢复速度,均明显快于model-1(P0.05),但model-4和model-1间无明显差异。类似的,model-2和model-3的肌肉再生比例明显低于model-1(P0.05),而model-2的新生血管比例明显少于model-1(P0.01)。在再生肌纤维比例和血管新生比例方面,model-4与model-1无明显差异。结论:Model-4的造模方法可得到类似于model-1的后肢缺血模型,而构建模型的难度相对简单。第二部分,方法:通过对不同模型方法的研究,model-1的HLI模型使用广泛且重复性良好,故选为本部分实验模型方法:取36只C57/BL6雄性小鼠构建左后肢缺血小鼠模型后,随机分为3个组:对照组(H_2O)、低浓度原花青素(low dose PC,LDPC)组(1 mg/kg)和高浓度原花青素(high dose PC,HDPC)组(20 mg/kg)。进行激光多普勒扫描,并记录缺血肢体的运动评分。在术后第7天和21天采集后腔静脉血浆和缺血侧腓肠肌(Gastrocnemius muscle,GC)。将血浆和缺血腓肠肌通过硫代巴比妥酸(TBARS)法测定脂质氧化的终产物丙二醛(MDA)的含量;腓肠肌HE染色后显微镜计数再生肌纤维占所有肌纤维的比例。取造模术后第7天的对照组和高浓度组的小鼠缺血侧腓肠肌,基因芯片检测miRNAs的表达谱;然后进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测mmu-miR-133b-3p的表达变化。通过TargetScan和miRanda两个miRNA靶基因预测数据库,通过寻找共同交集的方法,找到mmu-miR-133b-3p的预测靶基因集合。对该集合进行Gene Ontology和KEGG pathway分析,并纳入STRING分析蛋白间的相互作用,排除无联系的靶蛋白。最后蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定转录因子Pax7(Paired-box 7)、成肌分化抗原D(MyoD)、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP1)、P38-MAPK和磷酸化P38-MAPK的表达变化(以GAPDH为内参蛋白)。结果:高浓度PC组的缺血肢体运动机能恢复速度明显快于对照组和低浓度组(P0.05),低浓度组和对照组无显著差别。高浓度PC组血浆和肌肉MDA含量在7天时与另两组相比均明显降低(P0.05),21天时三组间并无统计学差异。缺血肌肉的再生肌纤维比例在7天和21天时均明显高于另外两组(P0.05)。通过基因芯片筛选出8个差异表达的miRNAs,其中mmu-mi R-133b-3p表达差异大,且丰度高。相对于对照组,高浓度组的缺血腓肠肌中miR-133b-3p表达上调,而PPP2CA、PPP2CB和MKP1可能是miR-133b的靶基因。Western印迹检测发现,Pax7和MKP1表达下调,MyoD和p-P38-MAPK的表达升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:1)原花青素可降低肢体缺血后的氧化应激水平,并促进肌纤维的再生;2)原花青素在促进肌纤维再生过程中,可能通过促进miR-133b-3p的表达,经MKP1/P38-MAPK信号通路轴发挥调控作用。
【图文】：

手术方法,股动脉,旋髂浅动脉,远点

mg/kg）控制术后疼痛。每只小鼠的造模过程控制在 10 min 内完成。6) 术后小鼠置于恒温加热台复苏，30 min 后再行激光多普勒扫描。3.1.2 不同结扎位点（图 1）1) model-1 采用经典[36]后肢缺血模型结扎位点：股动脉起点（旋髂浅动脉近端）和股动脉远点（乆隐动脉分叉处间）。将 model-1 作为对照组。2) model-2 使用 Limbourg 等[35]的方法：只结扎股动脉远点。3) model-3 的结扎点为：旋髂浅动脉与股深动脉之间的股动脉。4) model-4 综合取 model-2 和 model-3 的结扎点即是：旋髂浅动脉与股深动脉之间的股动脉和股动脉远点。术后均使用激光多普勒仪评估缺血后肢血流恢复情况，并使用运动功能评分评估运动功能恢复情况，比较 4 种模型间的差异。

股动脉,后肢,小鼠,股深动脉

西南医科大学硕士学位论文结果股动脉的解剖结构主要由股动脉供血，股动脉是髂外动脉经腹股段自上而下分别分支为：旋髂浅动脉主要供；股深动脉主要为大腿内侧群、后侧群肌肉股深动脉起点附近分支而来，，为腹壁侧肌肉动脉在膝关节上方分叉为隐动脉和乆动脉，分叉处之间发出，位置不甚恒定（图 2）。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543

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