【摘要】：研究背景动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理基础,是一种慢性炎症性疾病,其特征是脂质和炎性细胞在中、大动脉壁积聚。血管内皮氧化损伤被认为是动脉粥样硬化的首发和关键步骤。在生理状态下,血管内皮细胞有着重要的生理功能,如血管内外的物质交换,合成和释放血管活性介质等。近年来国内外越来越多的研究表明氧化应激、LOX-1与自噬在动脉粥样硬化形成和发展中有着交互错杂的关系。在氧化应激环境Lox-1参与ox-LDL的结合、吞噬及蛋白分解等一系列生物过程,从而达到清除受体的生物功能。自噬是细胞在外界环境各种刺激因素的影响下,细胞对受损的细胞器异常的蛋白质及病原体进行降解的生物学过程。微小RNA(miRNA)是一类内源性的长度大约为18-25个核苷酸的非编码RNA,能够调节mRNA的降解或抑制翻译在转录后水平上调节靶基因的表达。在体内miRNA在许多生物学功能中起着重要的作用如细胞的增殖、分化以及细胞凋亡等过程。研究发现在氧化应激下内皮细胞中许多miRNA的表达谱发生变化,其中,MiRNA199a-5P的变化最为显著。然而目前在慢性氧化应激环境下miRNA对内皮细胞的自噬和糖酵解水平的影响机制目前尚不明确。因此,我们在慢性氧化应激环境下miRNA199a-5p对内皮细糖酵解和自噬的影响。本研究以人脐静脉内皮细胞为研究对象,研究miRNA199a-5p在慢性氧化应激环境下对脐静脉内皮细胞的糖酵解和自噬调控机制。研究目的研究miRNA199a-5p在慢性氧化应激环境下对脐静脉内皮细胞的糖酵解和自噬中的调控作用。研究方法体外建立慢性氧化应激内皮细胞模型,并在此基础上向内皮细胞内转染miRNA199a-5p激动剂及抑制剂后,利用PCR,Western Blot等技术检测miRNA199a-5p对内皮细胞糖酵解和自噬的影响。研究结果在正常环境下,与对照组Lox-1含量比较,激动剂组降低、抑制剂组升高。与对照组HK2含量比较,激动剂组HK2含量升高;抑制剂组HK2蛋白含量降低。正常环境下,与正常组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ含量比较,激动剂组升高,抑制剂组降低。我们还发现Beclin-1含量、P62含量、ATG4含量在激动剂组降低而抑制剂组升高。我们实验发现给予细胞ox-LDL 72小时刺激后,与对照组Lox-1含量(0.053±0.000)比较,激动剂组Lox-1含量(0.015±0.002)降低、激动剂1组细胞Lox-1含量(0.006±0.002)降低;抑制剂组Lox-1含量蛋白含量(0.088±0.005)升高、抑制剂组Lox-1蛋白含量(0.093±0.002)升高。与对照组HK2含量(0.233±0.003)比较,激动剂组HK2含量(0.213±0.003)降低、激动剂1组细胞HK2含量(0.123±0.008)降低;抑制剂组HK2含量(0.311±0.006)增多,抑制剂1组细胞HK2含量(1.573±0.012)增多。与对照组LC3Ⅱ/Ⅰ含量(11.253±0.235)比较,激动剂组LC3Ⅱ/Ⅰ含量(28.653±0.509)升高、激动剂2组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ含量(13.803±0.454)升高;抑制剂组LC3Ⅱ/Ⅰ含量(5.853±0.117)降低,抑制剂2组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ含量(4.443±0.181)降低。与对照组Beclin-1含量(0.821±0.028)比较,激动剂组Beclin-1含量(0.738±0.012)降低,激动剂1组细胞Beclin-1含量(0.385±0.292)与降低;抑制剂组Beclin-1含量(1.373±0.038)增加、抑制剂1组细胞Beclin-1含量(1.405±0.041)增加。与对照组P62含量(2.196±0.031)比较,激动剂组P62含量(1.634±0.038)降低、激动剂1组细胞P62含量(1.543±0.066)降低;抑制剂组P62(2.630±0.057)增多,抑制剂1组P62含量(2.250±0.026)没有差异。与对照组ATG4含量(0.327±0.005)比较,激动剂组ATG4含量(0.227±0.005)降低、激动剂2组细胞ATG4含量(0.243±0.003)降低;抑制剂组ATG4含量(0.306±0.006)没有差异、抑制剂2组细胞ATG4含量(0.139±0.003)减少。我们同时还测定了己糖激酶活性,发现与对照组己糖激酶活性测定值19.730±1..806μ/gprot比较,激动剂组己糖激酶活性测定值7.167±3.941μ/gprot降低,激动剂2组己糖激酶活性测定值34.937±3.506μ/gprot升高;抑制剂组己糖激酶活性32.670±1.453μ/gprot升高,抑制剂2组己糖激酶活性11.450±1.006μ/gprot显著降低(图9B)。同时我们又测定了细胞内丙酮酸含量,发现与对照组丙酮酸含量测定值0.048±0.001μmol/mgprot比较,激动剂组测定值0.043±0.002μmol/mgprot无差异,激动剂1组测定值0.147±0.001μmol/mgprot没有升高;抑制剂组测定值0.056±0.001μmol/mgprot升高,抑制剂1组测定值0.042±0.001μmol/mgprot降低。我们进一步测定miRNA199a-5p含量,发现以对照组为参照,空白组miRNA199a-5p含量(1.026±0.029)与对照组没有差异,激动剂组miRNA199a-5p含量(1.769±0.069)、激动剂1组含量(1.403±0.026)高于对照组;抑制剂组miRNA199a-5p含量(0.560±0.035)、抑制剂1组含量(0.467±0.044)低于对照组。与对照组cav-1含量(6.780±0.169)比较,激动剂组cav-1含量(7.230±0.115)、激动剂1组细胞cav-1含量(6.53±0.154)没有差异;抑制剂组cav-1含量(13.230±0.138)升高,抑制剂2组细cav-1含量(4.610±0.193)降低。研究结论MiRNA199a-5p在慢性氧化应激环境中可以调节内皮细胞的糖酵解和自噬。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
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