重组腺相关病毒介导的microRNA投递在阿霉素心脏损伤及糖尿病心肌病中的作用与机制研究

发布时间：2020-06-11 11:01

【摘要】：研究背景与目的近年来随着治疗方法的进步,恶性肿瘤患者的生存率大大提高,幸存者已经形成了一个庞大的群体。肿瘤治疗所带来的心血管疾病风险非常普遍并深刻影响患者的生活和健康状况。阿霉素作为蒽环类抗肿瘤药的代表,是化疗药物导致心脏损伤的主要类型。目前阿霉素特异性心脏损伤的确切机制及防治手段尚不明确。临床研究发现贝伐珠单抗(VEGF抗体)与阿霉素联合应用使心脏损伤的发病率及严重程度异常增加,这提示血管稳态失衡可能在阿霉素心脏损伤中起重要作用。microRNA是一类内源性的小分子非编码RNA,已被证明广泛参与了多种生理及病理过程调控。miR-320a已被报道参与了缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、糖尿病微血管病变等一系列血管失稳态调控。在本研究中,我们发现阿霉素使心脏中的miR-320a显著增加,随后我们设计了一系列实验来探讨miR-320a在血管稳态失衡及阿霉素心脏损伤中的作用与机制。研究方法与结果首先,我们在C57BL6小鼠上建立了阿霉素心脏损伤的动物模型。干预阿霉素后,小鼠出现严重的心力衰竭。应用免疫组织化学的方法检测小鼠心脏组织中CD31与CD34的表达,发现这两种血管标志物在应用阿霉素后其表达都显著减低。Real-time PCR结果显示阿霉素使心脏组织的miR-320a显著上调,并且该效应具有相对的心脏组织和内皮细胞特异性。随后,我们使用9型重组腺相关病毒系统上调或下调阿霉素干预小鼠心脏中miR-320a的表达量。通过形态学、血流动力学、心脏超声等检测,我们发现高表达miR-320a加重了阿霉素引起的心脏组织微血管密度减低,eNOS表达下降,细胞凋亡增加及心功能受损,低表达miR-320a则具有保护作用。在体外实验中我们发现采用miR-320a mimics高表达miR-320a能抑制内皮细胞增殖,促进凋亡,使得迁移及成管能力下降,这些效应与阿霉素对内皮细胞的作用类似,而采用miRNA inhibitor降低miR-320a表达则能减少阿霉素引起的损伤。通过生物信息学预测并用Western blot与Ago2免疫共沉淀验证后,我们证实VEGF-A是miR-320a的靶点。那么VEGF-A是否介导阿霉素通过miR-320a导致的心脏损伤呢?最后我们设计了VEGF-A的体外siRNA敲减实验与体内腺相关病毒回输实验。我们发现在内皮细胞中敲减VEGF-A与高表达miR-320a的作用一致。体内实验中,在高表达miR-320a的基础上高表达VEGF-A抵消了miR-320a高表达引起的VEGF-A表达下降,也减轻了miR-320a高表达造成的阿霉素对心脏微血管密度、内皮细胞功能及心功能的损伤作用。结论综上所述,我们发现miR-320a通过调控血管稳态介导了阿霉素的心脏损伤作用,抑制miR-320a具有缓解阿霉素心脏损伤的临床价值。我们的研究从血管稳态的角度为阿霉素心脏损伤的机制提供了新的思路。研究背景与目的糖尿病已经成为全球性公共卫生问题。糖尿病心血管并发症严重影响了糖尿病患者的预后和生活质量。糖尿病心肌病是糖尿病心血管并发症的重要组成部分,与病人心衰、心肌梗死高风险密切相关。能量代谢紊乱在糖尿病心肌病发生发展中的重要作用已经明确。虽然心脏能量代谢紊乱来源于全身代谢紊乱,但是单纯纠正全身代谢指标并不能令人满意地减低心脏风险。寻找合适靶点直接干预心肌细胞的能量代谢,已成为研究热点。micro RNA是一类内源性的小分子非编码RNA,而且组织器官富集的micro RNA可特异性调控特定器官的生理及病理过程。mi R-30c已被报道参与肝脏与脂肪组织的代谢调控。然而mi R-30c作为一个心脏富集的micro RNA,在心脏代谢调控,特别是糖尿病心肌病心肌细胞代谢紊乱中的作用尚不明确。本研究通过腺相关病毒载体、动物模型系统及相应的细胞实验系统地研究了mi R-30c在糖尿病心肌病中的作用与机制。研究方法与结果首先,我们选择db/db鼠作为了糖尿病心肌病的动物模型。我们观察到28周龄的db/db鼠表现为心功能受损、心脏脂质沉积等糖尿病心肌病的典型表现。q PCR结果表明相对于C57BL/Ks对照鼠,db/db小鼠心脏组织及心肌细胞中的mi R-30c显著下调。随后,我们使用9型腺相关病毒及micro RNA mimics/inhibitor转染来改变db/db鼠心脏及H9c2细胞系中mi R-30c表达量探讨其在糖尿病心肌病中的作用。通过形态学、血流动力学、心脏超声等检测,我们发现高表达mi R-30c显著缓解了db/db小鼠心脏组织糖脂代谢紊乱、ROS水平升高、脂质沉积、细胞凋亡增加和心功能受损,低表达miR-30c则表现为相反的效果。在体外实验中FFA干预显著减少H9c2细胞mi R-30c的表达,高表达mi R-30c显著改善FFA干预引起的细胞糖脂代谢紊乱、脂质沉积、ROS水平升高ATP生成减少以及凋亡增加。通过m RNA芯片的数据挖掘,我们发现PPAR信号通路在糖尿病心肌病发生发展中十分重要。接下来我们在PPAR信号通路中预测到PGC-1β是mi R-30c的靶点,并用荧光报告基因实验、Western blot与Ago2免疫共沉淀实验验证。最后我们通过si RNA敲减实验、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、PPAR反应元件的荧光报告基因等实验明确了具体机制,即PGC-1β作为PPARα的共刺激因子介导了mi R-30c在糖尿病心肌病中的作用。结论综上所述,在糖尿病心肌病动物模型的心脏组织中升高mi R-30c的表达能够明显缓解心肌细胞的能量代谢紊乱,并且可以明显改善心脏功能,这些效应可能是通过抑制PPARα/PGC-1β实现的。重组腺相关病毒介导mi R-30c基因投递可为糖尿病心肌病的治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R542.2

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本文编号：2707809