剪切力调节血管内皮细胞功能及自噬的分子机制

发布时间：2020-06-11 19:50

【摘要】：研究背景心血管疾病以其高发病率,高死亡率和高致残率严重危害人类的身体健康。血管稳态是心血管病发生的重要基础。在血管内稳态的组成中,血管内皮细胞是血管稳态的重要组成部分。血管内皮细胞是循环血流与血管壁之间的重要屏障。生理状态下,血管内皮细胞发挥着重要的生理功能,如合成和释放血管活性介质、协助血管内外的物质交换等等。血流剪切力是血管内皮细胞直接承受的一种外界切应力,对血管结构和功能变化具有重要的影响,近年来的研究表明,高梯度的血流剪切力可以提高内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(e NOS)表达,增加一氧化氮(nitric oxide,NO)释放,诱导血管舒张,抵制动脉粥样硬化(AS)的发生,对血管具有保护作用。低血流剪切力被认为是与AS发生发展以及斑块破裂重要的相关力学因素之一。本研究分为两部分,分别研究剪切力在氧化应激条件下对血管内皮细胞功能的影响以及低剪切力调节血管内皮细胞自噬水平的分子机制。第I部分:剪切力对氧化应激状态内皮细胞一氧化氮合酶表达的影响氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是泡沫细胞形成的关键,同时可以通过促进巨噬细胞的增殖退化、促进血管收缩以及损伤血管内皮等机制最终导致AS的发生。NO是一种由血管内皮细胞分泌的重要活性物质,NO在调节血管张力、降低脂质水平、抑制粘附分子、血小板聚集和血管平滑肌细胞(VSMCs)的表达等方面起着重要作用。NO生成主要受e NOS的影响,其生成受损是内皮细胞功能紊乱的重要标志之一。但剪切力对ox-LDL作用下的内皮细胞e NOS表达的影响目前研究较少。研究目的探讨剪切力对ox-LDL作用下的内皮细胞e NOS表达的影响。研究方法将HAEC分为对照组和实验组,2组均采用精密输液泵施加剪切力,实验组同时给予ox LDL 100μg/m L共刺激。分别对两组细胞施加正常剪切力,低剪切力以及高剪切力的刺激,剪切力的大小分别为10、4、15 dyne/cm2。采用q-PCR及Western Blot技术检测e NOS m RNA和蛋白的表达,采用硝酸盐还原酶法测定NO含量。实验结果在实验组、对照组中,NO含量、e NOS m RNA表达水平以及e NOS蛋白的表达量4 dyne/cm2组均明显低于10 dyne/cm2组,15 dyne/cm2组均明显高于10 dyne/cm2组和4 dyne/cm2组;ox-LDL刺激组10 dyne/cm2亚组、4 dyne/cm2亚组及15 dyne/cm2亚组NO含量vs对照组相同亚组NO含量分别为:(1.09±0.33)μmol/L vs.(2.27±0.90)μmol/L、(0.20±0.08)μmol/L vs.(0.71±0.36)μmol/L、(3.03±0.71)μmol/L vs.(4.93±1.16)μmol/L。ox-LDL刺激组10 dyne/cm2亚组、4dyne/cm2亚组及15 dyne/cm2亚组e NOS m RNA vs对照组相同亚组e NOS m RNA分别为:(0.65±0.20)vs.(1.11±0.32)、(0.22±0.13)vs.(0.49±0.22)、(1.05±0.22)vs.(1.90±0.56)。ox-LDL刺激组10 dyne/cm2亚组、4 dyne/cm2亚组及15 dyne/cm2亚组e NOS蛋白vs对照组相同亚组e NOS蛋白分别为:(0.50±0.19)vs.(1.10±0.26)、(0.18±0.52)vs.(0.62±0.19)、(1.07±0.20)vs.(1.70±0.38)。即ox-LDL刺激组10dyne/cm2亚组、4 dyne/cm2亚组及15 dyne/cm2亚组NO含量,e NOS m RNA,e NOS蛋白均明显低于无ox-LDL刺激的相同亚组,差异具有统计学意义(P㩳0.05)。4 dyne/cm2组NO下降率明显高于10 dyne/cm2组,15 dyne/cm2组e NOS蛋白下降率、e NOS m RNA下降率和NO下降率明显低于4 dyne/cm2组,差异有统计学意义(P㩳0.05)。研究结论高剪切力可降低ox-LDL对内皮细胞e NOS活性的抑制作用,而低梯度剪切力可增强ox-LDL对内皮细胞e NOS活性的抑制作用。第II部分:mi R-21调节低剪切力诱导的内皮细胞自噬的分子机制自噬是细胞在外界环境因素的影响下,细胞对其内部受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入其内的病原体进行降解的生物学过程。研究发现,低血流剪切力可以影响内皮细胞的自噬水平,然而低血流剪切力影响内皮细胞的自噬水平的分子机制目前尚不明确。微小RNA(mi RNAs)是一类内源性的非编码RNA,长度大约为18-25个核苷酸,可以通过促进m RNA的降解或抑制翻译在转录后水平上调节靶基因的表达。Mi RNA在体内发挥许多生物学功能,例如参与细胞的增殖、分化、死亡以及组织的发育等。研究表明,Micro RNAs在剪切力调节血管内皮细胞的自噬过程中发挥着十分重要的作用。然而,micro RNAs在生物作用力下调节血管内皮细胞的自噬水平方面的作用以及分子机制目前尚不明确。微小RNA-21(Mi R-21)是迄今为止研究最为广泛的微小RNA之一。通过高通量筛选发现,当内皮细胞受到剪切力的刺激时,细胞中许多micro RNA的表达水平都会发生不同程度的变化,其中,mi R-21的变化最为明显。因此,我们推测剪切力可能通过mi R-21影响内皮细胞自噬水平。本研究以人脐静脉内皮细胞为研究对象,分析mi R-21对低剪切力条件下脐静脉内皮细胞的自噬水平的作用机制。研究目的研究mi R-21对低剪切力条件下脐静脉内皮细胞(HUVECs)的自噬水平的作用机制。研究方法体外建立剪切力作用的内皮细胞模型,并在此基础上向内皮细内转染mi R-21 mimics、mi R-21 inhibitor后,利用q-PCR,Western Blot,细胞免疫荧光以及透射电镜技术检测mi R-21对内皮细胞自噬水平的影响。研究结果利用Western Blot发现,与0 dyne/cm2相比,低剪切力组的HUVECs P62的表达水平由1.43±0.75下降到0.25±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平由1.64±0.22提高到4.8±0.80(P0.05),即低剪切力可以显著提高内皮细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平,P62的表达水平则降低(P0.05)。在低剪切力的基础之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,与低剪切力组相比,mimics组P62的表达水平由0.25±0.05提高到0.40±0.05,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平4.80±0.80下降到2.97±0.35(P0.05),inhibitor组P62的表达水平由0.54±0.04下降到0.33±0.42,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平由4.60±0.44上升到7.00±1.32(P0.05),即mimics组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低,P62表达显著升高(P0.05);而inhibitor组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著升高,P62表达显著降低(P0.05)。利用细胞免疫荧光发现,与0 dyne/cm2相比,低剪切力组的LC3Ⅱ阳性累积光密度值由448.79±118.47升高到1569.16±617.17(P0.05),即低剪切力可以显著提高内皮细胞中LC3荧光斑点数(P0.05)。在低剪切力的基础之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,与低剪切力组相比,mimics组LC3Ⅱ阳性累积光密度值由1569.16±617.17下降到381.33±108.27(P0.05),inhibitor组LC3Ⅱ阳性累积光密度值由3245.76±1047.90上升到16092.77±2215.37(P0.05),即mimics组LC3荧光斑点数显著降低,(P0.05);而inhibitor组LC3荧光斑点数显著升高(P0.05)。利用透射电镜发现,低剪切力可以显著提高内皮细胞中自噬小体的数量。在低剪切力的基础之上,采用mi R-21 mimics及mi R-21 inhibitor刺激后,与低剪切力组比较,mimics组内皮细胞中自噬小体的数量显著降低;而inhibitor组自噬小体的数量显著升高。研究结论mi R-21参与介导低剪切力调节人脐静脉内皮细胞自噬的作用。
【图文】：

剪切力,低剪切,高剪切,蛋白表达

图 1 剪切力对 eNOS 蛋白表达的影响注：与正常剪切力组相比，P*<0.05；与正常剪切力和低剪切力组相比较，2.1.2 剪切力对 eNOS mRNA 表达的影响当细胞给予正常剪切力、低剪切力和高剪切力的刺激后，eNOS mR

剪切力,低剪切

剪切力对eNOSmRNA表达的影响
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】