替普瑞酮在动脉粥样硬化中的保护作用及相关机制研究

发布时间：2020-06-12 04:18

【摘要】：目的:研究替普瑞酮(Geranylgeranylacetone,GGA)在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)中的作用及机制,并探讨热休克蛋白22(heat shock protein22,HSP22)在其中的作用。方法:细胞部分:1、筛选GGA对人冠状动脉内皮细胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)的最适作用浓度;2、将状态良好的HCAECs,传代后培养24h,分为4组,分别为对照组、GGA处理组、HSP22干扰组和HSP22干扰+GGA组,转染24h后,加用GGA干预,无水乙醇作为对照,处理12h后,再予ox-LDL处理24h;3、流式细胞学检测细胞凋亡,检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,RT-qPCR检测细胞HSP22、NF-κB mRNA水平,Western Blot检测HSP22、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达;动物部分:1、选取周龄为8-9周,基因型分别为ApoE~(-/-)(HSP22野生型)、HSP22~(-/-)//ApoE~(-/)(HSP22敲除型)雄性小鼠各16只,适应性喂养1周后,各分为2亚组,共4组,分别为野生HSP22组(wildtype groups,WT组)、野生HSP22+GGA处理组(wildtype+GGA groups,WT+GGA组),HSP22基因敲除组(HSP22 knockout group,KO组)与HSP22基因敲除+GGA处理组(HSP22knockout+GGA group,KO+GGA组),高脂喂养12周,其中GGA处理组和KO+GGA组从第5周始,予GGA(400mg/(kg·d))灌胃,其余各组灌予等量生理盐水作为对照,共处理8周;2、每周测小鼠体重,分别在干预前后检测小鼠血脂水平,ELISA检测血清HSP22浓度;3、主动脉整体油红O染色,主动脉弓及根部HE染色;4、Western Blot检测主动脉HSP22、NF-κB、eNOS及ICAM-1蛋白的表达。结果:1、GGA的最适作用浓度为1.0μmol/L;2、流式细胞学检测(1)细胞凋亡:对照组vs GGA组(31.78±3.27 vs 23.99±2.03,P0.05),GGA组细胞凋亡降低;对照组vs HSP22干扰组(31.78±3.27 vs 35.92±4.47,P0.05),细胞凋亡无明显变化;GGA组vs HSP22干扰+GGA组(23.99±2.03 vs33.24±4.85,P0.05),HSP22干扰+GGA组,细胞凋亡增加;HSP22干扰组vs HSP22干扰+GGA组(35.92±4.47 vs 33.24±4.85,P0.05),两组无明显差异;(2)ROS水平:对照组vs GGA组(308.0±23.52 vs 218.0±26.21,P0.05),GGA组ROS水平显著下降;对照组vs HSP22干扰组(308.0±23.52 vs 422.7±41.26P0.05),HSP22干扰组ROS水平显著上升;GGA组vs HSP22干扰+GGA组(218.0±26.21 vs 381.7±56.22,P0.05),HSP22干扰+GGA组ROS水平明显升高;比较HSP22干扰组和HSP22干扰+GGA处理组(422.7±41.26 vs 381.7±56.22,P0.05),两组ROS水平无明显差异。3、RT-qPCR(1)细胞HSP22 m RNA的相对表达量:与对照组相比,GGA组HSP22mRNA的相对表达量为1.85±0.189(P0.05),显著升高;HSP22干扰组和HSP22干扰+GGA组,HSP22 mRNA的相对表达量均很低,且无明显差异(0.30±0.281vs 0.25±0.215,P0.05);(2)细胞NF-κB m RNA的相对表达量:与对照组相比,GGA组NF-κB mRNA的相对表达量为0.68±0.052(P0.05),有所降低,HSP22干扰组NF-κB mRNA的相对表达量为1.43±0.160(P0.05),明显升高;GGA组vs HSP22干扰+GGA组(0.68±0.052 vs 1.31±0.327,P0.05),HSP22干扰+GGA组明显升高;HSP22干扰组vs HSP22干扰+GGA组,两组无明显差异(1.43±0.160 vs1.31±0.327,P0.05)。4、Western Blot检测HSP22、NF-κB、ICAM-1及eNOS的表达:(1)HSP22的表达:对照组vs GGA组(0.231±0.025 vs 0.364±0.058,P0.05),GGA组明显升高;HSP22干扰组和HSP22干扰+GGA组,HSP22的表达水平均很低,且无明显差异(0.090±0.015 vs 0.089±0.016,P0.05);(2)NF-κB的表达:对照组vs GGA组(0.781±0.092 vs 0.595±0.068,P0.05),GGA组有所下降;对照组vs HSP22干扰组(0.781±0.092 vs 1.042±0.102,P0.05),HSP22干扰组有所增加;GGA组vs HSP22干扰+GGA组(0.595±0.068 vs0.805±0.090,P0.05),HSP22干扰+GGA组显著升高;HSP22干扰组vs HSP22干扰+GGA组(1.042±0.102 vs 0.805±0.090,P0.05),HSP22干扰+GGA组有所下降;(3)ICAM-1的表达:对照组vs GGA组(0.447±0.061 vs 0.305±0.064,P0.05),GGA组有所下降;对照组vs HSP22干扰组(0.447±0.061 vs 0.589±0.045,P0.05),HSP22干扰组有所增加;GGA组vs HSP22干扰+GGA组(0.305±0.064vs 0.571±0.127,P0.05),HSP22干扰+GGA组显著升高;HSP22干扰组vs HSP22干扰+GGA组,两组无明显差异(0.589±0.045 vs 0.571±0.127,P0.05);(4)eNOS的表达:对照组vs GGA组,两组无明显差异(0.438±0.053 vs0.556±0.065,P0.05);对照组vs HSP22干扰组,两组亦无显著差异(0.438±0.053vs 0.381±0.092,P0.05);GGA组vs HSP22干扰+GGA组(0.556±0.065 vs0.406±0.048,P0.05),HSP22干扰+GGA组有所降低;HSP22干扰组vs HSP22干扰+GGA组,两组无明显差异(0.381±0.092 vs 0.406±0.048,P0.05)。5、血脂水平(1)基线水平:比较各组小鼠基线血脂水平,均无明显差异(P0.05);(2)干预后水平:各组小鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)均无明显差异(P0.05)。6、ELISA检测血清HSP22浓度:(1)干预前:WT组和WT+GGA组,小鼠血清HSP22的水平无明显差异(68.30±7.92 vs 70.77±7.78,P0.05),KO组及KO+GGA组小鼠血清中HSP22几乎检测不到,且无明显差异(17.53±3.01 vs 20.03±2.19,P0.05);(2)干预后:WT组vs WT+GGA组(192.3±25.69 vs 273.1±24.13,P0.05),WT+GGA组小鼠血清中HSP22的水平显著升高;KO组及KO+GGA组小鼠血清中HSP22仍然很低,且无明显差异(34.27±5.78 vs 36.53±6.11,P0.05)。7、组织病理学观察主动脉整体油红O染色计算小鼠主动脉斑块相对面积:WT组vs WT+GGA组(12.42±1.49 vs 6.82±0.83,P0.01),WT+GGA组明显减少;WT组vs KO组,两组无明显差异(12.42±1.49 vs 13.70±0.86,P0.05);WT+GGA组vs KO+GAA组,两组无明显差异(6.82±0.83 vs 7.16±2.29,P0.05);KO组vs KO+GGA组(13.70±0.86 vs 7.16±2.29,P0.01),KO+GGA组显著减少。主动脉根部HE染色计算小鼠主动脉根部斑块相对面积:WT组vs WT+GGA组(41.80±3.05vs 29.21±5.46,P0.05),WT+GGA组明显减少;WT组vs KO组(41.81±3.05 vs 48.24±2.40,P0.05),KO组有所增加;WT+GGA组vs KO+GGA组(29.21±5.46vs 35.82±3.67,P0.05),两组无明显差异;KO组vs KO+GGA组(48.24±2.40 vs 35.82±3.67,P0.05),KO+GGA组显著减少。8、Western Blot检测主动脉HSP22、NF-κB、ICAM-1及eNOS的表达:(1)HSP22的表达:WT组vs WT+GGA组(0.297±0.090 vs 0.593±0.080,P0.05),WT+GGA组表达增加;KO组和KO+GGA组看不到HSP22的条带,且无明显差异(0.057±0.021 vs 0.050±0.010,P0.05);(2)NF-κB的表达:WT组vs WT+GGA组(0.630±0.070 vs 0.357±0.090,P0.05),WT+GGA组有所降低;WT组vs KO组(0.630±0.070 vs 1.117±0.175,P0.05),KO组明显增加;WT+GGA组vs KO+GGA组(0.357±0.090 vs0.703±0.133,P0.05),KO+GGA组明显增加;KO组vs KO+GGA组(1.117±0.175vs 0.703±0.133,P0.05),KO+GGA组有所下降;(3)ICAM-1的表达:WT组vs WT+GGA组(0.183±0.031 vs 0.113±0.031,P0.05),WT+GGA组有所下降;WT组vs KO组(0.183±0.031 vs 0.327±0.080,P0.05),KO组显著升高;WT+GGA组vs KO+GGA组(0.113±0.031 vs 0.297±0.090,P0.05),KO+GGA组明显增加;KO组vs KO+GGA组,两组无明显差异(0.327±0.080 vs 0.297±0.090,P0.05);(4)eNOS的表达:WT组vs WT+GGA组,两组无明显差异(0.263±0.040vs 0.277±0.040,P0.05);WT组vs KO组(0.263±0.04 vs 0.160±0.046,P0.05),KO组有所下降;WT+GGA组vs KO+GGA组(0.277±0.040 vs 0.173±0.031,P0.05),KO+GGA组有所下降;KO组vs KO+GGA组,两组无明显差异(0.160±0.046 vs 0.173±0.031,P0.05)。结论:1、GGA能诱导HCAECs表达HSP22,且GGA对HSP22的诱导作用呈剂量依赖的关系;2、适当浓度的GGA可减少ox-LDL诱导的HCAECs凋亡,其主要机制为GGA诱导HSP22表达,进而下调NF-κB、ICAM-1;3、GGA能通过诱导HSP22表达,下调NF-κB、ICAM-1,减轻炎症反应,同时还能抑制粥样斑块形成,减少斑块面积,在AS的形成及进展中均发挥保护作用。
【图文】：

细胞凋亡,流式细胞仪检测,预处理

流式细胞仪检测细胞凋亡（n=3）（注：A、B、C、D、E、F 依次表示，浓度分别为 0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L、100μmol/L 的 GGA 预处理后，再加 ox-LDL 处理，，细胞凋亡的情况）

对照组,浓度

细胞凋亡水平比较（n=3）（注：与溶剂对照组相比,*为 P <0.05,**为 P<0.01）学检测细胞凋亡（图 1-1、1-2），如图所示，随 G有逐渐下降的趋势，与对照组相比，当 GGA 浓度
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

【参考文献】