CD137-CD137L信号通过Rab7调控自噬对小鼠血管平滑肌细胞外泌体分泌的影响
发布时间：2020-06-12 12:35
【摘要】：目的探讨CD137-CD137L信号是否通过Rab7分子调控自噬影响小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)外泌体的分泌。方法采用组织块贴壁法原代培养小鼠胸主动脉平滑肌细胞,取分离培养的第3-5代VSMC进行实验。实验分为四组:对照组;CD137激动组(CD137L重组蛋白10μg/ml,激动CD137信号);慢病毒对照组(对照干扰慢病毒干预+CD137L重组蛋白);Rab7慢病毒干扰组(Rab7干扰慢病毒干预+CD137L重组蛋白)。采用Western Blot法检测各组VSMC微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、p62及Rab7蛋白的表达。荧光显微镜观察自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染后自噬流变化。透射电镜观察VSMC来源外泌体的形态及大小,Western Blot法检测CD9、CD81及Hsc70外泌体相关标记物和自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达。NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)技术检测各组外泌体浓度及粒径大小。结果(1)在透射电子显微镜下,小鼠VSMC来源的囊泡状结构大小约30-150nm,Western Blot显示囊泡外泌体标记物CD9、CD81的高表达。(2)CD137激动组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达明显高于对照组(P0.05)。Rab7慢病毒干扰组Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达低于CD137激动组(P0.05)。慢病毒对照组与CD137激动组无差异(P0.05)。(3)各组VSMC自噬流显示:CD137激动组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均多于对照组(P0.05),且CD137激动组VSMC内黄色荧光点数多于红色。而Rab7慢病毒干扰组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均少于CD137激动组(P0.05),且Rab7慢病毒干扰组VSMC内红色荧光斑点数多于黄色。慢病毒对照组与CD137激动组无差异(P0.05)。(4)各组VSMC培养基中外泌体的分泌水平显示:CD137激动组细胞分泌的粒子数明显高于对照组(P0.05);Rab7慢病毒干扰组细胞分泌的粒子数明显低于CD137激动组(P0.05)。CD137激动组细胞分泌的外泌体中Hsc70蛋白表达高于对照组(P0.05);Rab7慢病毒干扰组细胞分泌的外泌体中Hsc70蛋白表达低于CD137激动组(P0.05)。慢病毒对照组与CD137激动组无差异(P0.05)。(5)各组VSMC培养基中外泌体的自噬相关蛋白表达:各组外泌体中可以检测到Lc3Ⅱ蛋白的表达,且CD137激动组外泌体Lc3Ⅱ蛋白表达高于对照组(P0.05),Rab7慢病毒干扰组外泌体LC3Ⅱ蛋白表达低于CD137激动组(P0.05),慢病毒对照组外泌体LC3Ⅱ蛋白表达与CD137激动组无差异(P0.05)。结论CD137信号可能通过Rab7调控自噬影响小鼠血管平滑肌细胞外泌体的分泌。
【图文】：
CD137-CD137L 信号通过 Rab7 调控自噬对小鼠血管平滑肌细胞外泌体分泌的影响进行方差齐性检验和多组间的方差分析，随后采用 LSD 进行显著性检验。以 P< 0.05 代表有统计学意义。所有实验重复至少三次，取其平均数通过 Graphpad 制图。2.3 结果2.3.1 小鼠原代主动脉 VSMCs 的观察及鉴定组织块贴壁后培养 3-4 天，可见组织块周围出现大小及形态不同的细胞，，如三角形、梭形及方形等。细胞生长起初非常缓慢，在经过多次传代后细胞生长速度较前明显增加，部分细胞区域可见山峰和山谷，即典型的峰谷样生长。原代平滑肌细胞传至第三代以后，可以使用 α-SMA-actin 抗体进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下，细胞质可见绿色放射样束状荧光即为平滑肌肌动蛋白，蓝色为经过DAPI 染色的胞核。如图所示：α-SMA 的阳性表达在 90%以上。（图 2.3.1）
图 2.3.2.小鼠血管平滑肌细胞来源的外泌体的鉴定。（图中 1、2 均为未予处理的小鼠血管平滑肌细胞培养基中的外泌体）。图左为电镜下 VSMC 来源的外泌体的形态（白色箭头所指）；图右为外泌体标记物 CD9、CD81 蛋白表达。Figure 2.3.2. Identification of exosomes derived from mouse vascular smooth muscle cells.2.3.3 Rab7 慢病毒敲低效率小鼠 VSMCs 细胞分为两组：对照组；Rab7 敲低组（加入 Rab7 干扰慢病毒，终浓度 6μg/ml，干扰 Rab7 的表达）。如图 Western blot 所示：Rab7 敲低组 VSMC 中 Rab7蛋白表达明显低于对照组（0.17±0.02 比 0.95±0.02，P<0.01）。（图 2.3.3）
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5
本文编号：2709537
【图文】：
CD137-CD137L 信号通过 Rab7 调控自噬对小鼠血管平滑肌细胞外泌体分泌的影响进行方差齐性检验和多组间的方差分析，随后采用 LSD 进行显著性检验。以 P< 0.05 代表有统计学意义。所有实验重复至少三次，取其平均数通过 Graphpad 制图。2.3 结果2.3.1 小鼠原代主动脉 VSMCs 的观察及鉴定组织块贴壁后培养 3-4 天，可见组织块周围出现大小及形态不同的细胞，，如三角形、梭形及方形等。细胞生长起初非常缓慢，在经过多次传代后细胞生长速度较前明显增加，部分细胞区域可见山峰和山谷，即典型的峰谷样生长。原代平滑肌细胞传至第三代以后，可以使用 α-SMA-actin 抗体进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下，细胞质可见绿色放射样束状荧光即为平滑肌肌动蛋白，蓝色为经过DAPI 染色的胞核。如图所示：α-SMA 的阳性表达在 90%以上。（图 2.3.1）
图 2.3.2.小鼠血管平滑肌细胞来源的外泌体的鉴定。（图中 1、2 均为未予处理的小鼠血管平滑肌细胞培养基中的外泌体）。图左为电镜下 VSMC 来源的外泌体的形态（白色箭头所指）；图右为外泌体标记物 CD9、CD81 蛋白表达。Figure 2.3.2. Identification of exosomes derived from mouse vascular smooth muscle cells.2.3.3 Rab7 慢病毒敲低效率小鼠 VSMCs 细胞分为两组：对照组；Rab7 敲低组（加入 Rab7 干扰慢病毒，终浓度 6μg/ml，干扰 Rab7 的表达）。如图 Western blot 所示：Rab7 敲低组 VSMC 中 Rab7蛋白表达明显低于对照组（0.17±0.02 比 0.95±0.02，P<0.01）。（图 2.3.3）
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5
【参考文献】
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1 许尧;陈蕊;丁亮;仲威;杨萍;李波;邵晨;王中群;严金川;;CD137-CD137配体信号通路通过JNK途径影响小鼠血管平滑肌细胞自噬[J];中华心血管病杂志;2018年05期
本文编号：2709537
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