小檗碱对血管平滑肌细胞钙化的影响及其机制初探

发布时间：2020-06-13 04:05

【摘要】：目的:血管钙化(vascular calcification)是血管重塑性疾病普遍存在的共同的病理表现,其主要特征为血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)发生成骨细胞样表型转化;除此之外还包括基质囊泡的形成、细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的增加、以及各种成软骨分化相关蛋白的出现或表达上调等。VSMC表型转化是血管钙化发生的关键环节,因此,表型转化抑制因子可能成为防止血管钙化的潜在干预靶点。小檗碱(Berberine,BBR)通过激活AMPK/p53/p21/Cip1通路,抑制Ras/Rac1/Cyclin D/Cdks通路,进而抑制血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)诱导的VSMC的增殖。在本研究中,我们观察了BBR对PDGF-BB诱导的VSMC钙化的影响,并对其分子机制进行了初步探讨,为临床防治心血管钙化提供更可靠的理论和实验依据。方法:1 VSMC培养选取60-80 g SD雄性大鼠(清洁级),于无菌环境下使用贴块法分离胸腹主动脉培养大鼠VSMC。待细胞生长汇合至75%-85%后,使用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-5代细胞进行实验。2细胞活力检测将处于对数生长期的VSMC接种于96孔板中,置于培养箱中预培养24 h后换用无血清培养基。利用CCK8试剂盒,分别测定BBR刺激不同浓度或者不同时间后,对细胞活力的影响。3细胞内钙含量测定将细胞重悬于含2%Triton-X100的PBS中,涡旋震荡使细胞充分裂解。离心后收集上清,进行蛋白定量,按照钙含量测定试剂盒说明书加入相应试剂后,用酶标仪测定610 nm处的吸光度值,并计算细胞中的钙含量。4 ALP活性检测将细胞重悬于含2%Triton-X100的PBS中,涡旋震荡使细胞充分裂解。离心后收集上清,进行蛋白定量,按照ALP检测试剂盒说明书加入相应试剂后,用酶标仪测定在405 nm处的吸光度值。5 Western blot分析将收集好的细胞重悬于细胞裂解液中,离心后收集上清进行蛋白定量。取等量的蛋白进行Western Blot,检测AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及p-AMPK的表达。结果:1.BBR对VSMC活力的影响细胞活力随着BBR刺激浓度的增高逐渐降低,呈浓度依赖性,100μM以上浓度的BBR明显降低细胞活力;细胞活力随着BBR刺激时间的延长逐渐降低,呈时间依赖性,刺激48 h后可以明显降低细胞活力。因此我们选择50μM BBR刺激细胞24 h进行后续实验。2.BBR对VSMC钙含量的影响PDGF-BB刺激48 h后可以明显促进细胞内钙含量增加,然而,给予BBR预处理后,PDGF-BB诱导钙含量增加的现象被抑制。结果表明,BBR可以抑制PDGF-BB诱导的VSMC钙化。3.BBR对ALP活性的影响PDGF-BB刺激48 h时可以明显促进细胞内ALP活性,然而,给予BBR预处理后,PDGF-BB诱导ALP活性增加的现象被抑制。结果表明,BBR通过抑制PDGF-BB诱导的ALP活性,进而抑制细胞钙化。4.BBR对AMPK表达的影响与对照组相比,随着PDGF-BB刺激时间的延长,AMPK的表达逐渐增加,24 h达到高峰,48 h仍维持在较高水平,说明PDGF-BB可以诱导VSMC中AMPK的表达。然而,用50μM BBR预处理24 h后,无论有无PDGF-BB刺激,BBR都对AMPK的表达没有影响。5.BBR对AMPK磷酸化的影响与对照组相比,随着PDGF-BB刺激时间的延长,AMPK磷酸化水平没有明显变化。然而,50μM BBR预处理24 h后,无论有无PDGF-BB刺激,BBR可以明显促进AMPK磷酸化。结果表明,BBR可能通过诱导AMPK磷酸化,抑制PDGF-BB诱导的VSMC钙化。结论:1.BBR抑制PDGF-BB诱导的VSMC钙化。2.BBR可能通过诱导AMPK的磷酸化活化,抑制PDGF-BB诱导的VSMC钙化。
【图文】：

图 1 BBR 对 VSMC 细胞活力的影响Fig.1Effects of BBR on VSMC viabilityere stimulated with BBR at 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800or 24 h. Cell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05. B: VSMCs were stimulated with 50 μM BBR for 6, 12, 2ell viability was measured by CCK8 kit. *P < 0.05, compare

BBR对ALP活性的影响
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

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本文编号：2710617