METTL3调节M~6A甲基化修饰介导的前体miR34a加工诱导腹主动脉瘤发生发展

发布时间：2020-06-15 20:42

【摘要】：研究背景腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种发病率高且危害大的慢性炎症血管疾病。尽管外科手术日益进步,其一旦破裂,死亡率仍超过80%。目前研究认为延缓AAA的发展是遏制这一灾难性后果发生的关键。在临床上,戒烟、血压、血脂和血糖控制等生活方式和代谢改善是延缓AAA发展的常规措施,但仍不足以控制AAA进展。现在研究观点阻断AAA形成的发病机制可能被视为阻止或延缓AAA发展的一种有前景的潜在策略。N6甲基腺苷(M6A)介导超过80%的RNA甲基化,被认为是真核生物中最常见的信使RNA转录后修饰,也是非编码RNA常见的转录后修饰。RNA中的M6A修饰通过促进前体RNA剪切、信使RNA翻译和增强RNA稳定性等途径在各种生物学过程中发挥作用。目前的研究表明RNAM6A转录后修饰在多种病理生理过程中起着关键作用,如癌细胞生长、急性髓细胞白血病、胚胎干细胞生长分化和T细胞稳态。近期研究也发现RNA M6A转录后修饰在如心肌缺血和心肌细胞再生中起着关键作用。有趣的是,我们的初步实验发现,在AAA样本中,RNA的M6A修饰水平增高,并且这种上调是由M6A转移酶METTL3升高引起的。这些现象结果发现引起思考:METTL3或RNA中的M6A修饰是否参与AAA的进展。近期的其他研究也暗示这一可能,研究发现METTL3增加了炎症细胞因子的表达,激活了与AAA发生发展相关的NF-κ B信号通路。此外,METTL3可促进了 miRNA前体的发生M6A修饰,从而增加M6A修饰介导的miRNA前体加工,进而增加成熟的微小RNA(miRNA)形成。考虑到既往大量文献报道miRNA在主动脉瘤的形成中是至关重要的。综上所述,我们假设METTL3通过促进M6A RNA的修饰,从而促进miRNA前体加工成成熟miRNA,导致血管炎症的发生进而参与AAA的形成。为了验证假设,我们在两个AAA模型中探讨了 METTL3对AAA发展的影响。进一步对METTL3的作用机制进行探索,发现METTL3促进与血管衰老,炎症相关的miR-34a的前体加工成成熟miR-34a。再者,为了说明miR-34a在AAA发生中起关键作用,我们还通过腺相关病毒进行敲低和过表达miR-34a,并探索其潜在机制。研究方法与结果一,METTL3功能实验研究结果发现:(1)在ApoE-/-小鼠中,用AAV病毒敲低METTL3抑制AngⅡ诱导的腹主动脉瘤发生率,减少血管最大直径,抑制血管巨噬细胞浸润和抑制弹力纤维降解,而且抑制金属蛋白酶2(MMP2),P21以及单核趋化蛋白1(MCP1)的表达;(2)在C57BL/6J小鼠中过表达METTL3则促进Ang Ⅱ诱导的腹主动脉瘤形成,相应的病理变化结果趋势也与敲低实验结果相反;(3)METTL3促进主动脉瘤发生的现象也在氯化钙模型上得到验证。二,机制研究研究发现,(1)MeRIP-qPCR实验结果发现在腹主动脉中pri-miR-34a M6A甲基化位点的M6A修饰水平增加,敲低和过表达METTL3分别抑制和增加pri-miR-34a的M6A甲基化位点的M6A修饰水平;(2)敲低METTL3显著抑制miR-34a的表达,增加pri-miR-34a的表达;(3)抑制METTL3表达可以减少甲基化的RNA与RNA剪接相关蛋白DGCR8的结合。结论本研究证实,METTL3可通过增加pri-miR-34a的M6A修饰,促进M6A修饰介导的pri-miR-34a的前体加工成熟miR-34a,进而抑制SIRT1的表达,促进血管平滑肌衰老和血管炎症,从而发挥促进腹主动脉瘤发生和发展作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.1
【图文】：

ＲＮＡ甲摧化去转移酶，这两大类酶则司维持的。顾名}、义ＭｆｔＡ邋ＲＮＡ甲基化转移逡逑酶是维持Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲柚化水＇丨／：，而Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲裉化ｉ转移酶坫擦除Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ逡逑甲基化水平。实时定量ＰＣＲ结果（图１－２）表明：在腹主动脉瘤模型中，Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ逡逑甲基化去转移酶表达量基本在两种标本中表达没有变化，提示腹主动脉瘤Ｍ６Ａ逡逑ＲＮＡ甲基化水平增高不是Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化去转移酶引起的。逡逑Ｉ—Ｉ邋Ｓａｌｉｎｅ邋■邋ＡＡ逡逑ｔｉｌｌ逡逑Ｕ邋Ｕ邋ＭＥＴＴＬ４邋ＡＬＫＢＨ５邋ＹＴＨＤＦ２邋ＦＴＯ邋ＫＩＡＡ１４２９逡逑１７逡逑

逡逑图１－２邋Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化去转移酶在盐水组和血管紧张素ＩＩ组的ｍＲＮＡ水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ邋－２邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ６Ａ邋ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ邋ｉｎ邋Ａｎｇ邋ＩＩ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＡＡＡ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑既然ＲＮＡ甲基化去转移酶没有表达差异，接着我们进一步探索ＲＮＡ甲基化逡逑转移酶在两组中的表达，实时定量ＰＣＲ（图１－３显示ＭＥＴＴＬ３邋（６．９±０．６０倍，＊Ｐ＜０．０５，逡逑ｎ＝４）和ＭＥＴＴＬ１４邋（２．０５±０．２７６倍，＊Ｐ＜０．０５，邋ｎ＝４）的ｍＲＮＡ表达水平显著高于对照逡逑组的水平（Ｐ＜０．０１），尤其是ＭＥＴＴＬ３显著高表达，提示腹主动脉瘤中的Ｍ６Ａ逡逑修饰的差异可能是由ＭＥＴＴＬ３升高导致的。逡逑［□Ｓａｌｉｎｅ逦ＡＡ逡逑８邋＊＊逡逑．１逦ｉ逡逑＜＆逦ｅ邋－逦丨逡逑Ｉ逡逑ｃｒ逦４－逦化逡逑＾逦■逦Ｉ逡逑Ｉ逦ＪｎＭ逦ｎｉ邋ｎａ逡逑ＭＥＴＴＬ３逦ＭＥＴＴＬ１４逦ＷＴＡＰ逡逑图１－３邋Ｍ６Ａ邋ＲＮＡ甲基化转移酶在盐水组和血管紧张素ＩＩ组的ｍＲＮＡ水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ６Ａ邋ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ｉｎ邋Ａｎｇ邋ＩＩ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＡＡＡ邋ｍｏｄｅｌ．逡逑此外，我们进一步在两组标本中检测了邋ＭＥＴＴＬ３的蛋白水平改变。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑ｂｏｌｔｉｎｇ的结果显示：ＭＥＴＴＬ３的蛋白水平也是在腹主动脉瘤中高表达（图１－４），逡逑正如既往研究所报道

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本文编号：2714966