共培养体系中CMECs与心肌细胞相互调控作用研究

发布时间：2020-06-20 14:47

【摘要】：缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD),如心肌梗塞,中风和外周血管疾病是全世界致死致残最常见的原因之一,其组织损伤程度直接与血流程度以及缺血时间有关~([1])。药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗以及冠状动脉旁路移植术是目前IHD的重要治疗手段,对于缩小心梗面积、改善心脏功能具有重要意义。然而,即使冠状动脉血流改善,临床上也有相当一部分患者的微血管灌注阻塞,慢性心功能受损,以及微血管损伤导致的扩张型心肌病。缺血/再灌注损伤(Ischemia/reperfusion injury,I/RI)是指因冠状动脉血流恢复,导致微血管内皮障碍及心肌细胞损伤加重的一种现象。在接受再灌注治疗的急性心肌梗死患者中,就约有30%发生这种现象~([2])。同时突然恢复血流也会导致一些微血管阻塞,这个现象称为无复流现象~([3])。无复流导致患者预后变差,并与梗死区扩大、充血性心力衰竭和死亡增加相关~([4])。心肌I/R损伤发病的关键是微血管功能障碍,其中心肌微血管内皮细胞(Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)发挥重要作用~([5])。因此,了解CMECs在I/R过程中的作用机制可能为IHD提供新的治疗方向。CMECs是位于微血管和血管壁之间的关键界面,具有调节组织液体平衡和提供生物体存活所需的必需营养素的重要功能,是心脏非心肌细胞的主要成分。先前已有研究证明再灌注诱导CMECs释放可溶性促凋亡介质促进心肌细胞凋亡~([5]),这暗示CMECs在心肌I/R损伤期间触发心肌细胞损伤中起关键作用。此外,在I/R过程中CMECs凋亡先于心肌细胞,且凋亡的心肌细胞围绕在凋亡的CMECs周围~([6]),以及在体外CMECs可以通过分泌IL、TNFα、MCP、ET以及Ang II等等细胞因子加重心肌损伤,同时也可以分泌一些生物活性物质保护心肌细胞,如NO。综上,CMECs-心肌细胞的相互作用在心脏MI/RI中占有重要的地位,但其相互作用的具体作用机制尚不明确。本实验建立CMECs-H9c2共培养模型,通过模拟缺血/再灌注损伤建立缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygen-ation,H/R)模型,观察H/R条件下CMECs、H9c2是否发生相互作用,并初步探讨其作用机制。方法(1)大鼠I/R模型构建:大鼠沿左冠状动脉前降支结扎1h再灌24h,且分别于术前术后取血留样;HE染色,观察大鼠心脏形态变化;TUNEL染色,观察大鼠心脏组织损伤情况。(2)比较NO和ET-1在大鼠I/R组和sham组的表达:通过试剂盒检测大鼠血清中NO、ET-1的表达情况。(3)CMECs的分离、鉴定:酶消化法分离得到CMECs,免疫荧光以及Matrigel基质胶诱导血管形成实验鉴定CMECs。(4)CMECs/H9c2缺氧/复氧模型构建:利用低氧工作站分别建立CMECs、H9c2的缺氧/复氧模型,并检测其相应指标。(5)CMECs对H9c2的作用:收集H/R后CMECs培养基上清,将其作用于H9c2,LDH、MTS和RT-PCR检测CMECs对H9c2的作用;构建H9c2和CMECs共培养H/R体系,WB检测H9c2凋亡相关蛋白的表达。(6)H9c2对CMECs的作用:收集H/R后H9c2细胞培养基上清,将其作用于H/R后的CMECs细胞,LDH、MTS、Transwell和RT-PCR检测H9c2对CMECs的作用;建立H9c2和CMECs共培养H/R体系,RT-PCR检测CMECs炎性因子表达变化,(7)初步探讨H9c2与CMECs相互作用的机制:通过试剂盒检测H/R前后CMECs细胞培养基上清中NO、ET-1的含量变化。结果(1)HE染色:大鼠I/R组心肌组织排列紊乱,血管受损,并伴有炎症细胞浸润;TUNEL染色:与sham组相比,I/R组梗死区心肌及血管内皮细胞TUNEL阳性信号明显增强。(3)血清检测NO和ET-1结果显示:与sham组相比,模型组NO和ET-1的表达量均升高,但NO/ET-1下降。(4)成功建立成年大鼠CMECs分离、鉴定、体外扩增的稳定平台。(5)H/R后CMECs细胞培养基上清作用于H9c2后,MTS和LDH检测结果显示CMECs H/R后培养基上清促进H9c2的增长和减轻H9c2缺氧/复氧损伤;RT-PCR结果显示CMECs H/R后培养基上清抑制H9c2 H/R后炎性相关因子的表达;WB检测结果显示H9c2与CMECs共培养H/R后凋亡相关蛋白的表达降低。(6)H/R后H9c2细胞培养基上清作用于CMECs后,MTS和LDH检测结果显示H9c2 H/R后培养基上清加重CMECs缺氧/复氧损伤;RT-PCR结果显示H9c2 H/R后培养基上清促进CMECs缺氧/复氧后炎性因子的表达;Transwell结果显示H9c2 H/R后培养基上清抑制CMECs的迁移。结论(1)大鼠I/R心脏组织梗死区心肌细胞和血管内皮细胞损伤加剧,血清中NO、ET-1表达异常;(2)CMECs缺氧/复氧后上清对H9c2起保护作用,H9c2与CMECs共培养缺氧/复氧后H9c2损伤减轻。(3)H9c2缺氧/复氧后上清加重CMECs缺氧/复氧损伤,CMECs与H9c2共培养缺氧/复氧后CMECs损伤加重。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：

图 3.1 大鼠心肌微血管内皮细胞分离流程图3.2.2 CMECs 的传代待体外诱导分化得到的心肌微血管内皮细胞长到 80%左右，用 PBS 洗三遍，加入5%的胰酶消化 10s 左右，在镜下观察，待细胞变圆还未漂起来时，用 20%FBS-CMECs基终止消化，轻柔吹打细胞，制成细胞悬液，移至离心管中，500g 离心 5min，用FBS-CMECs 培养基重悬细胞，1:3 传代。3.2.3 CMECs 的复苏与冻存（1） 细胞冻存：当细胞长至 80%左右，用胰酶把细胞消化下来移至 15mL 离心管500g 离心 5min，弃上清，用冻存液重悬细胞后转移到标记有标签的冻存管中，放存盒中 24 小时后放入液氮长期保存。（2） 细胞复苏： 从液氮或者-80℃低温冰箱取出细胞，迅速放入 37℃水浴锅中融待完全融化后，在生物安全柜中将细胞移至 15mL 离心管中，500g 离心 5min，弃

4 实验结果4 实验结果4.1 成功建立大鼠心肌 I/R 模型4.1.1 TTC 染色鉴定大鼠心肌 I/R 模型Wistar 大鼠随机分成两组，缺血/再灌组（I/R 组）和 sham 组，I/R 组大鼠缺血灌 24h，sham 组为对照组，处理后进行 TTC 染色。如图 4-1 所示：I/R 组心脏组织色梗死区，sham 组心脏组织无白色梗死区。结果说明：大鼠缺血/再灌（I/R）模型成功。

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本文编号：2722574