AKAP5锚定PKA对HERG通道的慢性调节作用及机制研究

发布时间：2020-06-21 03:16

【摘要】：心脏性猝死(sudden cardiac death,SCD)是由于心脏无法有效泵血而导致的一种急性症状,其特征包括意识丧失和呼吸骤停,如果不及时治疗,最终会引起死亡。严重的室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)是心脏性猝死最主要的原因之一。大量离子通道分布在心肌细胞膜,快激活延迟整流钾电流(the rapid component of IK,IKr)在维持心肌动作电位的平台期和3期复极期阶段起重要作用,HERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码IKr的α亚单位,HERG基因突变会引起心脏IKr电流减少,产生与7号常染色体有关的先天性长QT综合征(long QT sydrome 2,LQTS-2)。LQTS通常与各种室性心律失常相关,特别是尖端扭转性室速(torsades de piontes,TDP)。具有高发心脏性猝死的风险。研究表明激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可通过抑制IKr电流实现对HERG通道的急性调节。然而,和急性调节不同,慢性调节发生于数小时或更晚时间,常涉及蛋白基因的转录及转录后调节。相关文献指出,在异源表达系统或心肌细胞中,长时间激活PKA可使HERG通道蛋白表达量明显增加,其中PKA直接磷酸化HERG通道蛋白在这一过程中起到了一定的作用。A型激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring protein,AKAP)是一组功能上相关而结构上不同的蛋白质,所有AKAP都能结合PKA。除此之外,AKAP还能与多种信号分子结合,构成信号复合物,靶向特定的区域,从而实现相应的功能。心肌细胞中共发现有十几种AKAP,在心肌肥厚,心律失常,心肌缺血,心力衰竭等疾病中都观察到AKAP的表达出现了明显的改变,提示其在心脏的病理进程中起着重要的作用。AKAP5是一种广泛表达的锚定蛋白,可以与PKA,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),钙调神经磷酸酶(calcineurin,Ca N),钙调蛋白(calmodulin,Ca M)和其他信号分子相互作用,但AKAP5是否能通过结合PKA慢性调节HERG通道目前仍不清楚。因此,本研究拟在异源表达系统上,采用分子生物学,基因干预等技术研究AKAP5对HERG通道的慢性调节作用并初步探索其机制。本研究的完成给未来LQTS提供新的防治靶标,可以有效的预防心脏性猝死,具有重要的现实意义。第一部分:表达HERG通道蛋白和AKAP5锚定蛋白的细胞株的建立和鉴定目的:建立能单独表达HERG钾通道蛋白和AKAP5锚定蛋白与能同时表达上述两个蛋白的HEK293细胞株。方法:用Lipofectamine2000转染试剂将HERG基因和AKAP5基因分别转染和共转染到HEK293细胞株上,HERG基因和AKAP5基因的转染情况由琼脂糖凝胶PCR鉴定,转染后细胞HERG蛋白和AKAP5蛋白的表达情况由Western blot检测。结果:琼脂糖凝胶PCR结果显示AKAP5和HERG质粒在HEK293细胞中能正常表达,Western blot结果显示AKAP5锚定蛋白和HERG钾通道蛋白能正常表达。结论:成功建立了能单独表达HERG和AKAP5与同时表达上述两个蛋白的HEK293细胞株。第二部分:AKAP5对HERG钾通道蛋白的慢性调节作用目的:在不同浓度或不同处理时间下对转染后细胞应用PKA激动剂forskolin,观察AKAP5锚定蛋白的存在是否能影响到HERG钾通道蛋白的表达。方法:将转染后细胞分为只表达HERG的HEK293-HERG组和同时表达HERG和AKAP5的HEK293-HERG+AKAP5组,在不同浓度或不同处理时间下应用PKA激动剂forskolin孵育该两组细胞后,Western Blot检测HERG蛋白的表达量。结果:对HEK293-HERG和HEK293-HERG+AKAP5两组细胞应用PKA激动剂forskolin 1μm、10μm、1000μm 24小时或应用forskolin 10μm 6h、12h、24h后都可使HERG的表达量明显上升。HEK293-HERG+AKAP5组相较于HEK293-HERG组,HERG的表达量的增加更为明显。结论:AKAP5参与PKA对HERG钾通道蛋白的慢性调控作用。第三部分:AKAP5对HERG钾通道蛋白慢性调节作用的分子机制探讨目的:在细胞水平阐明AKAP5对HERG钾通道蛋白慢性调节的分子机制,即AKAP5可能通过特异性锚定和激活PKA慢性调节HERG钾通道。方法:应用免疫荧光和免疫共沉淀检测HERG,AKAP5和PKA的结合和共定位。结果:免疫荧光和免疫共沉淀显示,HERG和PKA,AKAP5相互结合并共定位于细胞膜上。结论:AKAP5可能通过特异性锚定和激活PKA直接磷酸化HERG钾通道蛋白慢性调节HERG钾通道。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541
【图文】：

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皖南医学院硕士学位论文结果1 HEK293 细胞的形态学特征在倒置显微镜下观察，细胞贴壁生长，有少量细胞代谢物，总体上细胞形态完整，胞质中央存在圆形细胞核，形态清楚，反光良好，细胞与细胞之间连接紧密，相互衔接。A B

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图 2：转染后各组 HEK293 细胞培养图片（100×）。C 和 D：转染后 HEK293-HERG 转染组细胞培养图片。E 和 F：转染后 HEK293-AKAP5 转染组细胞培养图片。G 和 H：转染后HEK293-HERG+ AKAP5 共转染组细胞培养图片。3 DNA 连接后的测序结果与 HERG 和 AKAP5 碱基序列比对，结果完全一致，证实了载体构建成功，保证了 HERG 和 AKAP5 的正常表达。4 琼脂糖凝胶 PCR 鉴定两个基因的转染情况，结果显示 AKAP5和 HERG 质粒在 HEK293 细胞中能正常表达。

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