远隔缺血适应对心肌缺血再灌注损伤的基础和临床研究

发布时间：2020-06-21 04:49

【摘要】：研究背景:急性ST段抬高型心肌梗死(ST-Elevation Myocardial Infarction,STEMI)给人类造成沉重的健康与经济负担,迅速地开通闭塞冠状动脉“罪犯血管”(culprit vessel),是限制梗死范围(infarction size,IS)的最有效方法,然而,缺血心肌再灌注可能导致额外的心肌损伤,称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。2003年,Zhao等提出缺血后适应(ischemic postconditioning,IPost C)概念,可挽救心肌,然而,最大的DANAMI-3-i POST试验和最新荟萃分析结果阴性。1993年Przyklenk最早提出远隔缺血适应概念(Remote ischemic conditioning,RIC),RIC可以在心肌梗死发生后再灌注实施前(远隔缺血时适应remote ischemic perconditioning,RIPer C)、再灌注实施后(远隔缺血后适应remote ischemic postconditioning,RIPost C)实施。然而,Verouhis等人最近临床研究,使用多达7个下肢RIPost C周期,至少有一个周期在再灌注前开始,未能减少前壁STEMI梗死范围。RIPOST-MI研究RIPer C与IPost C联合没有进一步减少梗死面积。LIPSIA CONDITIONING研究,院内RIPer C与IPost C联合干预,RIPer C+IPost C提高心肌挽救指数。鉴于近年临床研究IPost C阴性报道,我们将目光转向RIC,尤其是RIPer C与RIPost C联合。魏盟等使用在体大鼠心肌梗死模型RIPer C和RIPost C组合未能进一步提供保护,该实验RIPer C与RIPost C时间紧密连接在一起,RIPer C与RIPost C时间间隔为零,类似于一种循环次数加强的远隔缺血适应过程,过度适应“hyperconditioning”可能是有害的。RIPer C与RIPost C有一定的时间间隔才符合临床,因此,需要探索RIPer C间隔一定时间再实施与RIPost C的联合,观察是否比一种RIC获益。细胞自噬在心肌IRI中起关键作用,魏超研究大鼠IR模型,活化的自噬在心肌缺血后适应中,对心肌起保护作用。韩志华研究,在正常小鼠而非糖尿病(DM)小鼠,RIPost C诱导心肌细胞自噬减轻IRI。然而,心肌IRI中RIPer C涉及到自噬的研究尚未见报道。基质衍生因子-1α(Stromal derived factor 1α,SDF-1α)、一氧化氮(NO)可能是缺血后适应保护性体液因子,RIPer C如何影响STEMI患者SDF-1α、NO表达尚无研究。鉴于以上研究背景,我们寻求证明:⑴RIPer C与RIPost C联合应用能否减轻IRI,对心脏具有保护作用?RIPer C与RIPost C联合是否优于一种RIC?⑵RIPer C如果有心脏保护作用,RIPer C诱导的心脏保护是否与自噬有关?⑶SDF-1α、NO是RIPer C对STEMI患者保护机制之一吗?第一部分远隔缺血适应对兔心肌缺血再灌注损伤的基础研究目的:在体兔心肌缺血再灌注模型评估远隔缺血时适应(RIPer C)与远隔缺血后适应(RIPost C)组合是否产生协同效应。RIPer C诱导的心脏保护作用是否涉及自噬?方法:雄性新西兰大白兔随机分成8组。1:假手术组(Sham组)。2:缺血再灌注模型组(IR组)(Model组),心肌缺血40分钟,再灌注3小时。3:远程缺血时适应组(RIPer C)。4:远程缺血后适应组(RIPost C)。5:U1组-远程缺血时适应+远程缺血后适应,两组间隔0分钟。6:U2组-远程缺血时适应+远程缺血后适应,两组间隔5分钟。7:U3组-远程缺血时适应+远程缺血后适应(RIPost C)两组间隔10分钟。8:3MA组-3MA+远程缺血时适应(RIPer C)。RIC方案为-对左侧股动脉用微血管夹阻断血流5分钟,松开五分钟,重复三个循环。检测再灌注3小时血清肌钙蛋白I(c Tn I),电镜观察心肌形态学和自噬活性改变,Real-time PCR法检测Beclin-1、LC3、P62、Bcl2、Bax、Caspase 3六个基因相对含量在兔心肌中表达水平。喂养四周后,超声心动图检查,测量左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd),左心室收缩末期内径(LVIDs),左室射血分数(left ventriculare jection fraction,LVEF),左室短轴缩短率(fraction shortening,FS)。通过斑点追踪应变评估左心室整体纵向收缩期峰值应变(GLPS),用2,3,5—氯化三苯基四氮唑(TTC)染色确定心肌梗死面积。结果:1.各组兔体重无差异(P0.05)。七组在结扎冠状动脉后均有心电图II导联ST段弓背抬高,松开结扎线后10分钟ST段均回落,ST段回落无组间差异(P0.05)2.血清肌钙蛋白I,与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组c Tn I均升高(P0.05),与IR组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组c Tn I均减少(P0.05)。RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组之间c Tn I无统计学差异。3-MA+RPer C组c Tn I比RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组升高。3.RIC对心肌梗死面积的影响Sham组TTC染色无梗死。心肌梗死面积(IS/LV),IR组33.72±9.96%,RIPer C组21.37±11.11%,RIPost C组24.75±6.50%,U1组20.75±6.63%,U2组24.00±9.31%,U3组19.58±7.23%,3-MA+RPer C组38.86±8.66(P0.05)。与IR组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组梗死面积均减少(P0.05),3-MA+RPer C组心肌梗死面积无统计学差异。RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组之间,梗死面积无统计学差异。4.RIC对左室功能的效应各组GLPS结果(负值):Sham组21.5125±2.7378,IR组10.4667±1.5338,RIPer C组10.6222±3.9493;RIPost C组11.1444±3.2269,U1组13.9889±2.4882,U2组13.5667±3.1008,U3组12.6667±2.0304,3-MA+RPer C组12.2444±2.5274(P0.05)。与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组GLPS绝对值均减小(P0.05);与IR组比较,U1、U2组GLPS绝对值增大,RIPer C、RIPost C、U3、3-MA+RPer C组组间无统计学差异。各组EF结果:Sham组63.5000±4.3753,IR组44.5556±3.5746,RIPer C组49.1111±7.3220;RIPost C组49.7778±4.2361,U1组50.3333±2.9580,U2组53.1111±5.1343,U3组49.6667±4.0927,3-MA+RPer C组48.6667±3.6742。与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组EF值均减小(P0.05);与IR组比较,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组EF值均增大(P0.05),IR组与3-MA+RPer C组组间无统计学差异。各组FS结果:与IR组比较,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组FS值均增大(P0.05),IR组与3-MA+RPer C组组间无统计学差异。各组LVEDd结果:与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组均无统计学差异;LVIDs结果:与Sham组相比,RIPer C、RIPost C、U2、3-MA+RPer C组LVIDs值增加(P0.05);与IR组比较,U3组LVIDs值增大(P0.05)。5.Real-time PCR法检测Beclin-1、LC3、P62、Bcl2、Bax、Caspase 3六个基因相对含量。LC3 m RNA与Sham组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组均升高(P0.05),IR组升高但无统计学差异(P0.05)。与IR组比较,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组均升高,(P0.05)。与3-MA+RPer C组比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3均高(P0.05)。Beclin-1 m RNA与Sham组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组均升高(P0.05),IR、3-MA+RPer C组无统计学差异(p0.05)。与IR组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组均升高(P0.05),3-MA+RPer C组无统计学差异(p0.05)。RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组组间无统计学差异(p0.05)。P62 m RNA与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组均降低(P0.05);与IR组相比,RIPost C、U1、U2、U3组无统计学差异(p0.05)。Bcl2/Bax与Sham组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组均增大(P0.05);IR、3-MA+RPer C组组间无统计学差异(p0.05)。caspase3 m RNA与Sham组相比,IR、RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3、3-MA+RPer C组均增大(P0.05);与IR组相比,RIPer C、RIPost C、U1、U2、3-MA+RPer C组均减小(P0.05),U3无统计学差异(p0.05)。RIPer C、RIPost C、U1、U2、U3组组间无统计学差异(p0.05)。6.透射电子显微镜检测自噬小体结果在IR组,心肌纤维排列整齐,线粒体可见水肿,线粒体膜完整,自噬小体数与Sham组相比显著增多,每1000μm2中的自噬小体数为39.67±4.93;在RIPer C组有多个双层膜包裹着发生皱缩的线粒体的吞噬小体,每1000μm2中自噬小体数为90.67±12.06;RIPost C组、U1组、U2组、U3组中,线粒体可见水肿,自噬小体数与RIPer C组一样,均明显增加,每1000μm2中自噬小体数分别为106.7±16.26、94±17.09、106.3±26.5、97.67±7.02,各组之间没有显著性差异。RIPer C组、RIPost C组、U1组、U2组、U3组与IR组相比,自噬小体数量有显著性差异(P0.01);在3MA组,线粒体部分肿胀,线粒体嵴清晰可见,膜完整,自噬小体数较少,每1000μm2中自噬小体数为57±7,与RIPer C组、RIPost C组、U1组、U2组、U3组相比,自噬小体数量有显著性差异(P0.05)。结论1.RIPer C、RIPost C处理均减少梗死范围,减轻IRI,但RIPer C和RIPost C组合未能提供进一步的保护,不产生协同效应。2.RIPer C诱导了自噬,抑制细胞凋亡,活化的自噬在远隔缺血时适应中对心肌起保护作用。第二部分远隔缺血时适应对STEMI患者心肌缺血再灌注损伤的临床研究目的:探讨肢体远隔缺血时适应(Remote ischemic perconditioning,RIPer C)对急性ST段抬高性心肌梗死(ST-Elevation Myocardial Infarction,STEMI)患者心肌缺血再灌注损伤的影响。方法:研究对象为苏州大学附属第一医院2016年1月-2017年6月确诊STEMI并行急诊直接经皮冠脉介入治疗(Primary Percutaneous Coronary Intervention,PPCI)患者共78人。随机分为远隔缺血时适应组(PPCI+RIPer C组:n=40)和对照组(PPCI组:n=38),两组均接受PPCI。远隔缺血时适应组在球囊扩张前针对左下肢行RIPer C。术前和术后0.5、8、24、48、72小时抽取患者静脉血测定血清肌酸磷酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、血清基质衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1alpha,SDF-1α)、一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度。术后第7天心脏超声评估左心功能。结果:1.两组在性别、年龄、危险因素、入院时生命体征、缺血时间、冠脉病变情况、造影剂用量、植入支架情况等方面均无统计学差异。2.远隔缺血时适应组相较对照组术后CK-MB峰值明显减低(334.13±42.87ng/ml VS 387.21±64.12 ng/ml,P0.01)。远隔缺血时适应组CK-MB曲线下面积中位数为728.36[365.63-931.98],对照组曲线下面积中位数为817.00[683.30-1126.00],远隔缺血时适应组较对照组CK-MB曲线下面积明显减低(P=0.02)。3.两组应用各时间点血清SDF-1α浓度绘制曲线,计算出曲线下面积。远隔缺血时适应组中位数为421.800[304.200-619.000],对照组为357.000[258.600-479.800],远隔缺血时适应组显著高于对照组(P=0.044)。4.两组应用各时间点血清NO浓度绘制曲线,计算出曲线下面积。远隔缺血时适应组中位数为5.726[3.924-13.173],对照组中位数为4.836[3.297-6.142],远隔缺血时适应组显著高于对照组(P=0.035)。5.两组术后心脏超声评估LVEF,PPCI+RIPer C组及PPCI组患者术后LVEF分别为51.56±6.57%,49.50±6.38%,(P=0.164),两组无显著差异。结论:针对左下肢行RIPer C可以降低STEMI患者心肌酶评估的梗死面积,升高术后血清一氧化氮(NO)以及基质细胞衍生因子-1a(SDF-1a)水平。SDF-1a和NO可能参与RIPer C的心脏保护。动物实验和临床研究结论:RIPer C和RIPost C组合不产生协同效应,RIPer C诱导了自噬,活化的自噬在远隔缺血时适应中对心肌起保护作用。升高的SDF-1a和NO可能参与RIPer C对STEMI患者的保护。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2
【图文】：

冠状动脉,即心,微血管,开胸手术

图 1. 实验方案. 兔稳定十分钟后随即分成 8 组兔开胸手术: i) 假手术组 (冠状动脉穿线但不结扎); ii) 缺血再灌注组(结扎冠状动脉左室支四十分钟，再灌注三小时iii) RIPerC 组-冠状动脉结扎但未松开时，即心肌缺血时，对左侧股动脉应用微血管夹阻断血流 5 分钟，松开五分钟，重复三个循环); iv) RIPostC 组-冠状动脉松开后即心肌再灌注后即刻，对左侧股动脉微血管夹阻断血流 5 分钟，松开五分钟，重复三个循环; v) U1 -远程缺血时适应 + 远程缺血后适应：两组间隔 0 分钟。Vi) U2: 远程缺血时适应 + 远程缺血后适应组：两组间隔 5 分钟. . Vii) U3 -远程缺血时适应+ 远程缺血后适应组：两组间隔 10 分钟. Viii) 3-MA 组-3MA 耳缘静脉注射十分钟实施远程缺血时适应组. IR, ischemia/reperfusion. RIPerC, remote ischemic perconditioninRIPostC, remote ischemic postconditioning.Figure 1. Experimental protocols. Rabbits underwent open-chest surgery. Subsequent to a 10 mistabilization period, they were randomly assigned into eight groups: i) Sham group (rabbits underwensham surgery); ii) IR (rabbits underwent 40 min left anterior descending artery occlusion, followed by

心电图,股神经,股静脉,股动脉

13图 3 分离左侧股动脉、股静脉、股神经四、研究内容4.1 心电监护：将 7 号注射器针头扎入兔四肢皮下作为电极，将多道生理信号采集处理系统和心电图仪电极线与其连接。术中持续心电监护，并在术前、结扎左室支 15 分钟后以及再灌注 15min 后，分别记录Ⅱ导联心电图，观察并分析心律、心率、ST 段等的变化。

【参考文献】