GLP-1抑制Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的作用研究

发布时间：2020-06-21 20:26

【摘要】：目的:1、探讨GLP-1对Ang Ⅱ所诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响;2、进一步探究GLP-1对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响的分子机制。方法:1.细胞培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(rat aorta smooth muscle cells,RASMCs)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基中生长,置于含5%CO_2的37℃恒温培养箱中,每1~2天更换培养基,取处于对数生长期的细胞用于下一步实验。2.细胞增殖测定将RASMCs(1×10~4个/mL)接种于96孔板,边缘孔使用PBS填充;5%CO_2 37℃培养箱中培养至细胞单层铺满96孔板孔底的90%;之后更换无血清培养基再分别加入不同的浓度的药物:GLP-1、exendin-4、Ang Ⅱ、forskolin、H89、Y-27632浓度分别为20nM、10nM、100 nM、10μM、10μM、10μM,药物处理24h后每孔加入20μL MTT溶液,继续在培养箱中培养4h,弃去培养液后再向每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO),将96孔板置于摇床上低速震荡10min,利用酶联免疫检测仪检测各孔570nm处的吸光值,每个实验组设置6个复孔,测定并计算均值,统计学分析比较各组细胞增殖率变化情况。3.细胞迁移测定将RASMCs接种于6孔板,待细胞长至90%融合后,用200μL规格的移液枪枪头(黄色)进行细胞表面划痕,使用PBS去除悬浮细胞后更换无血清培养基,再分别加入不同浓度的干预组药物(分组及药物干预浓度同上),药物干预前及24h后利用尼康倒置显微镜观察拍照后,使用尼康图像分析软件测量划痕宽度,统计学分析各组细胞迁移率。4.Western blot检测以RIPA裂解液提取细胞蛋白,使用BCA法测定蛋白质浓度。在40μg蛋白的溶液中加入五分之一体积的5×蛋白Loading buffer,100℃金属浴5min,上样。电泳,转膜后使用5%脱脂奶粉在室温下封闭2h,加入不同稀释比例的一抗,在4℃孵育过夜(RhoA及ROCK2稀释比例为1:200,p-MLC/MLC/β-actin稀释比例为1:1000),1×TBST缓冲液漂洗后,分别加入HRP标记的山羊抗兔(或鼠)二抗(稀释比例1:10000),室温孵育2h后,进行显影曝光。使用Image J软件扫描各条带灰度值,进行统计学分析。5.统计方法使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析及作图,实验数据以mean±SD表示,多组间比较采用One-way ANOVA和方差齐性检验,两组间两两比较采用t检验,若P0.05则认为差异具有统计学意义。结果:1.GLP-1抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs增殖MTT法检测RASMCs细胞增殖能力,结果显示GLP-1单独处理对细胞增殖无影响,利用Ang Ⅱ处理细胞后,增殖能力与对照组相比明显升高(P0.05),进一步利用GLP-1干预后,RASMCs增殖能力显著降低,呈现药物浓度依赖性,其中20nmol/L GLP-1处理效果最佳。揭示GLP-1对Ang Ⅱ所诱导的RASMCs增殖的抑制作用呈浓度依赖性。在检测周期蛋白cyclinD1表达时观察到,GLP-1可以降低Ang Ⅱ引起的RASMCs中cyclinD1的表达升高(P0.05),致使细胞增殖被抑制,与MTT结果一致。2.GLP-1抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs迁移细胞划痕实验检测RASMCs细胞在不同处理条件下的迁移能力,结果显示:与对照组相比,Ang Ⅱ组的细胞迁移水平提高(P0.05),而加入GLP-1干预后明显抑制了Ang Ⅱ所诱导的细胞迁移能力(P0.05)。通过对MLC磷酸化水平的分析发现,GLP-1降低了RASMCs中Ang Ⅱ引起的MLC磷酸化水平的升高(P0.05)。3.GLP-1抑制Ang Ⅱ诱导的RhoA及ROCK2表达Ang Ⅱ处理RASMCs 24h后,Western blot检测RASMCs中RhoA及ROCK2的表达水平后发现二者均较对照组升高(P0.05),当加入GLP-1干预后,RhoA及ROCK2的表达受到抑制(P0.05),随着GLP-1浓度的不断升高,抑制作用也逐渐增强;给予GLP-1受体激动剂exendin-4及cAMP激动剂forskolin作用于GLP-1一致;但是同时给予PKA抑制剂H89时,RhoA/ROCK2表达相比Ang Ⅱ+GLP-1组显著升高(P0.05)。以上结果说明,在RASMCs中GLP-1可能是通过cAMP/PKA调控RhoA/ROCK2信号通路。4.GLP-1通过cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信号通路抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs增殖为了进一步验证cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信号转导通路在GLP-1抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs增殖中所发挥的作用,我们再次通过MTT及cyclinD1的表达变化检测对增殖的影响。结果显示,与Ang Ⅱ单独干预组相比,在其基础上分别加入GLP-1、exendin-4、forskolin或ROCK2抑制剂Y-27632都能不同程度的抑制Ang Ⅱ诱导的细胞增殖(P0.05);加入H89后,GLP-1的作用受到明显抑制,细胞增殖率再次升高(P0.05);同时给予GLP-1及Y-27632干预后与单独给予GLP-1相比,增殖率进一步降低(P0.05)。Western blot检测cyclinD1蛋白表达变化与增殖检测结果一致,GLP-1、exendin-4、forskolin都能不同程度抑制Ang Ⅱ诱导的cyclinD1表达升高(P0.05),加入H89后GLP-1、exendin-4作用均减弱,与Ang Ⅱ+GLP-1组、Ang Ⅱ+exendin-4组相比,加入H89组的cyclinD1的表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632也可抑制Ang Ⅱ引起的RASMCs中cyclinD1表达升高(P0.05);同时加入GLP-1与Y-27632后,较单一给予GLP-1组cyclinD1表达进一步下调(P0.05)。5.GLP-1通过cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信号通路抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs迁移通过细胞划痕实验观察到,加入GLP-1、exendin-4、forskolin或Y-27632都能不同程度的抑制Ang Ⅱ诱导的细胞迁移(P0.05);当加入H89干预后,GLP-1、exendin-4对Ang Ⅱ诱导的RASMCs迁移的抑制作用发生逆转,细胞迁移变化明显(P0.05);同时发现,Y-27632也能抑制Ang Ⅱ诱导的细胞迁移,同时给予GLP-1及Y-27632干预后与单独给予GLP-1相比,细胞迁移得到进一步抑制(P0.05);通过对MLC磷酸化水平检测发现,加入H89干预后,GLP-1、exendin-4对Ang Ⅱ诱导MLC磷酸化的抑制作用减弱,MLC磷酸化水平升高(P0.05);Y-27632可以抑制Ang Ⅱ诱导的MLC磷酸化(P0.05);当GLP-1与Y-27632同时干预RASMCs后,MLC的磷酸化水平进一步下降(P0.05)。结论:GLP-1能通过cAMP/PKA/RhoA/ROCK2信号转导通路抑制Ang Ⅱ诱导的RASMCs增殖及迁移。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

2.1 Ang II 促进的血管平滑肌细胞增殖AngII作为RAAS中关键因子，在心血管系统中的作用至关重要，许多研究都证实其能有效的诱导血管平滑肌细胞的增殖。我们利用AngII从不同的干预时间（图1-1A）及浓度（图1-1B）发现，促进血管平滑肌细胞增殖最明显的干预浓度为10-7mol/L（P＜0.05），干预时间为24h（P＜0.05），之后的实验研究采用同样的干预时间及浓度。图1-1：Ang II促进血管平滑肌细胞增殖A.不同的Ang II干预时间对血管平滑肌细胞增殖的影响；B. 不同的Ang II干预浓度对血管平滑肌细胞增殖的影响；*P＜0.05 vs 0h组或Ang II 0mol/L组。Fig.1-1 Ang II promoted RASMCs proliferationA. The effects of different Ang II intervention time on RASMCs proliferation; B. The effects of differentAng II Intervention Concentrations on RASMCs Proliferation. Data are presented as means ±SD (*P＜0.05 vs Time 0h or Ang II 0mol/L).

2.2 GLP-1 抑制 Ang II 诱导的血管平滑肌细胞增殖为了排除GLP-1本身对血管平滑肌细胞增殖的可能影响，我们使用了不同浓度的GLP-1单独处理细胞，结果显示GLP-1本身对细胞增殖无影响（图1-2 A）。同时，MTT法检测细胞增殖结果显示，利用AngII处理细胞后，增殖能力与对照组相比明显升高，进一步利用GLP-1干预后（图1-2B），血管平滑肌细胞增殖能力显著降低，呈现药物浓度依赖性，其中20nmol/L GLP-1处理效果最佳（P＜0.05）。揭示GLP-1对Ang II所诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。图1-2：GLP-1抑制Ang II诱导的血管平滑肌细胞增殖A.不同的GLP-1浓度单独干预后对血管平滑肌细胞增殖的影响；B. 不同的GLP-1干预浓度对AngII诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响；*P < 0.05 vs. control组, # P < 0.05 vs. Ang II组。Fig.1-2 GLP-1 inhibited Ang II-induced proliferation in RASMCsA. The effect of various concentrations of GLP-1 (5, 10, 20, and 30 nM) on RASMC proliferation. Cellproliferation was determined using the MTT assay. B. The effect of GLP-1 (5, 10, and 20 nM) on Ang II-induced RASMC proliferation. Cell proliferation was determined using the MTT assay. Data arepresented as means ±SD (*P < 0.05 vs. control, # P < 0.05 vs. Ang II).2.3 GLP-1 抑制 Ang II 所诱导 cyclinD1 表达CyclinD1是一种普遍存在于真核细胞中的周期蛋白，通过与周期蛋白依赖性激酶

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本文编号：2724595