血管紧张素原经megalin受体介导动脉粥样硬化形成

发布时间：2020-06-27 08:19

【摘要】：研究背景:动脉粥样硬化是造成多种心血管疾病的最主要原因,是目前威胁全球人类健康的首要杀手。肾素-血管紧张素系统(RAS)在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。血管紧张素原(AGT)是RAS的唯一底物,主要来源于肝脏,它在肾素的酶切作用下形成血管紧张素 Ⅰ(AngⅠ)和无 AngⅠ合成功能的des(AngⅠ)AGT,血管紧张素转换酶(ACE)进一步剪切AngⅠ生成血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),后者是动脉粥样硬化的重要促进因子。然而,目前对于AGT合成AngⅡ并发挥促动脉粥样硬化效应的调控机制尚不明确。Megalin属于低密度脂蛋白受体家族,主要在极化的上皮细胞中表达。既往的研究证实,megalin在肾脏的近端小管中与AGT存在相互作用。本课题旨在探索megalin是否参与调控AGT转换为AngⅡ的过程及动脉粥样硬化的形成。研究方法及结果:为了证实AGT促动脉粥样硬化作用的AngⅡ依赖性,我们构建了肝细胞特异性AGT敲除且低密度脂蛋白受体敲除(LDLR-/-)的双基因敲除小鼠(简称hepAGT-/-)及其同窝表达 AGT 的 LDLR-/-小鼠(简称 hepAGT+/+)。hepAGT+/+小鼠予注射空载腺相关病毒(AAV),hepAGT-/-分别注射空载AAV、携带野生型AGT或des(AngⅠ)AGT的AAV,通过高脂喂养12周诱导动脉粥样硬化,发现hepAGT-/-小鼠的动脉粥样硬化较hepAGT+/+显著减轻,野生型AGT AAV显著增加hepAGT-/-小鼠的动脉粥样硬化面积,而des(AngⅠ)AGT AAV对hepAGT-/-小鼠的动脉粥样硬化无明显作用。为了探究AGT敲除对AngⅡ水平的影响,我们检测了 hepAGT+/+与hepAGT-/-小鼠血浆和肾脏的AngⅡ含量,发现两者血浆AngⅡ无显著差异,而hepAGT-/-小鼠的肾脏AngⅡ含量较hepAGT+/+小鼠显著降低。通过免疫荧光染色发现,在hepAGT+/+小鼠中,megalin、AGT、肾素及ACE共同定位于肾脏近端小管。反义寡核苷酸(ASO)抑制megalin的表达后,近端小管中的AGT和肾素消失,同时尿液中两者的含量显著升高。此外,抑制megalin后小鼠的肾脏AngⅡ含量显著降低,而血浆AngⅡ浓度无改变。为了研究megalin是否参与动脉粥样硬化的形成,我们予雄性和雌性LDLR-/-小鼠注射megalin ASO,并设立PBS和control ASO注射组作为对照,通过高脂喂养12周发现,抑制megalin显著减少了动脉粥样硬化的形成。通过生物信息学分析,我们发现AGT分子远端存在高度保守序列。为了研究这些保守序列是否介导AGT与megalin结合,我们构建了保守序列突变的AGT重组蛋白,在体外通过表面等离子共振技术发现,AGT突变体与megalin的亲和力减弱。为了探究AGT的保守序列是否影响动脉粥样硬化形成,我们予hepAGT-/-小鼠注射携带突变AGT的AAV,并设立hepAGT+/+及hepAGT-/-小鼠注射空载AAV为对照,高脂喂养12周后发现注射AGT突变体后hepAGT-/-小鼠的动脉粥样硬化面积与hepAGT+/+小鼠无差异。结论:本研究揭示了 megalin是肾脏内RAS稳态和动脉粥样硬化形成的重要调控因子,提示megalin介导的肾脏AngⅡ生成在动脉粥样硬化中起重要作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

粥样硬化,小鼠,依赖性,促进作用

ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的血浆ＡＧＴ水平低于其同窝ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠的１０％，逡逑而注射携带各ＡＧＴ重组体的ＡＡＶ后，ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的血浆总ＡＧＴ浓度达到与逡逑ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠一致水平（图１Ａ）。通过ｔａｉｌ－ｃｕｆｆ法测量小鼠尾动脉血压发现，逡逑ｈｅｐＡＧＴ－Ｍ、鼠血压显著低于ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠，ＷＴ邋ＡＧＴ可升高ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的逡逑血压，而ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ对血压无影响（图１Ｂ）。经过１２周高脂饲料喂养后，我逡逑们发现予空载病毒注射的ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠的动脉粥样硬化显著减轻，ＷＴＡＧＴ逡逑ＡＡＶ注射后ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠动脉粥样硬化斑块面积大小与ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠相近，逡逑而ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ注入ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠后并不发挥促动脉粥样硬化作用（图１Ｃ－逡逑Ｄ）。以上结果提示，肝源性ＡＧＴ是动脉粥样硬化形成的关键因子，其促动脉粥逡逑样硬化效应主要依赖于Ａｎｇｌｌ，而非ｄｅｓ（ＡｎｇＩ）ＡＧＴ。逡逑２５逡逑

肾脏,血浆,小鼠,浓度

逦正文结果逡逑异（图２Ａ），提示系统性的Ａｎｇｌｌ激活并非促进动脉粥样硬化病理形成的直接诱逡逑因。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑血浆逦肾脏逡逑２０００邋逦邋２０００邋逦逡逑１邋１５００逦＾邋１５00逦Ｔ逦Ｐ＝０００７逡逑ｃｎ逦ｃｎ逡逑■逡逑Ｃ邋１０００逦？逦１０００逡逑５００邋５0°＇逡逑＿＿0Ｌ＾Ｈ＿＿逡逑ｈｅｐＡＧＴ＋／＋邋ｈｅｐＡＧＴ－／－逦ｈｅｐＡＧＴ＋／＋邋ｈｅｐＡＧＴ－／－逡逑图２邋ｈｅｐＡＧＴ＋／＋和ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠血浆及肾脏中Ａｎｇｌｌ的浓度。Ａ，小鼠血浆逡逑Ａｎｇｌｌ浓度；Ｂ，小鼠肾脏Ａｎｇｌｌ浓度；ｎ．ｓ．：无统计学差异。逡逑我们的既往研究排除了在巨噬细胞及血管壁成分细胞中Ａｎｇｌｌ的局部产生或逡逑激活对动脉粥样硬化的影响［３６－３９］，因此目前对于动脉粥样硬化中Ａｎｇｌｌ产生位逡逑点和作用靶点仍不明确。肾脏是ＲＡＳ合成并发挥病理生理学功能的重要器官，其逡逑自身的Ａｎｇｌｌ合成量远高于血液循环中Ａｎｇｌｌ的浓度［２２－２４］。因此我们进一步检逡逑测了肾脏的Ａｎｇｌｌ水平，发现ｈｅｐＡＧＴ＋／＋小鼠的肾脏Ａｎｇｌｌ含量高达其血浆浓度逡逑的近１０倍；同时，在敲除肝脏ＡＧＴ后，肾脏Ａｎｇｌ丨的生成量显著下降（图逡逑２Ｂ）。以上结果提示，ｈｅｐＡＧＴ－／－小鼠动脉粥样硬化的减轻与其肾脏Ａｎｇｌｌ含量逡逑下降相关

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